結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

注:各高分子の沈殿物のステップは同時に行う洗浄に続いて順次実行されます。ただし、それは RNA を隔離推奨それは本質的に安定していないので、最初。 1. サンプル コレクション 適切な成長条件1910 cm プレートあたり 1,000 のワームの卵をシードします。72 h 20 ° C で孵化させなさい。注:上記の19として卵を収集するために卵を持った大人を漂白剤します。 約 5 mL の M9 バッファーを洗浄してチューブに 1,000 大人のワームを収集します。注:M9 バッファーは、滅菌水19の硫酸マグネシウム 1 mM 22 mM リン酸-、カリウム、塩化ナトリウム 102 mM 35 mM ナトリウム リン酸水素で構成されます。 1 分、1,000 x gでワームを遠心分離機、上澄みを廃棄し、M9 バッファーの 1 つの mL を小球形にされたワームを 1.5 mL 遠心チューブに転送します。 再び 1 分 845 × gで遠心、上清のほとんどを破棄します。4 h の最小-80 ° C で小球形にされたワームを格納します。注:冷凍餌を使用して新鮮なペレットよりも高い利回りを生成します。ワーム キューティクルをクラックするドライアイスの液体窒素または 95% エタノールを使用して凍結/解凍サイクルのシリーズをお勧めします新鮮なペレットを使用している場合。ペレットに M9 の少量を残して凍結時にキューティクルを破るのに役立ちます。 2. ヌクレオチドおよび蛋白質の隔離 解凍のペレットから任意の上清を除去し、冷たい GTCp 試薬 1 mL を追加します。上下にピペッティングでよく混ぜます。10 分間氷の上、サンプルを置き、それを逆さま回すことによって時折まぜます。注意:フェノールは神経毒性、腐食性、毒性の高いを化学火傷や失明を引き起こす可能性があります。注:報告されたボリュームを出発原料として最大 5,000 の成虫を使いました。各ボリュームは、GTCp 試薬 1 mL の使用に基づいています。大きいサンプルを使用する場合は、スケール アップする必要があります。 ワームや GTCp のソリューション、冷たいクロロホルム 200 μ L を追加します。指の間チューブを保持、積極的に振る 15 s. 休暇のそれ 3 分の室温 (RT) で。注意:クロロホルムの毒性刺激は、皮膚の傷と、他の器官をターゲットとした害を引き起こす可能性があります、可能な発癌物質。 4 ° C で 15 分間 13,500 x gでチューブを遠心分離します。注:このスピンした後 3 つの層で形成: 脂質や DNA を含む小さな、曇りの相間、ピンクの有機相下部クリア水相トップ。 新しい RNase フリー 1.5 mL の微量遠心チューブ (管 A) (として 2.5 の手順で詳細な) アルコール沈殿によって RNA を分離し新しいチューブ (残りのペレットからピンク層 (有機相) を移動する明確なトップ層 (水相) マイクロ ピペットを使用して、移動します。チューブ B) と氷の上に置きます。注:ピンク有機相は、DNA および蛋白質はこのサンプルからの分離まで-80 ° C で凍結することができます。大きいサンプル水溶液と有機相の間の厚い白い層が生成されます。この画分には DNA が含まれています。このレイヤーは、他の段階を乱すことがなく削除することができます、そう、別の管 (管 B2) でそれを置きます。 とおりの RNA を隔離します。 チューブ A でクリア水相からの 100% イソプロピル アルコール液 500 μ L の RNA の沈殿物します。室温 10 分間インキュベートします。4 ° C で 10 分間 13,500 × gで遠心管 A、注:RNA の小さな白いペレットが管の下部に表示されます。 上清の大半をデカントします。針で 1 mL 注射器で残りの部分を削除し、上澄みを廃棄します。注:針のサイズが重要でないです。ただし、大きい針のゲージはペレットを邪魔しないようにより詳細に制御を提供します。マイクロ ピペットは、針が利用できない場合に使用できます。 75% エタノール 1 mL をチューブ、ペレットを洗浄する A に追加します。4 ° C で 5 分間 5,300 × gでチューブをスピンします。 2.5.2 の手順で説明されているようにデカントして針で 1 mL 注射器を使用ペレットから上澄みを除去し、それを破棄します。 ペレットを聞かせて 5-10 分の風乾が overdry それをさせてください。RNase フリー水の 50 μ L を使用して、それは完全に透明になる前に RNA のペレットを再構築します。注:これは 1,000-3,000 のワームのための適切な開始ボリュームが、それはどのくらいの原料が使用されたに応じて調整する必要があります。 55-60 ° c 10 分で溶解するペレットを孵化させなさい。 濃度と純度分光光度計を使用して測定します。260 で吸光度を記録 RNA 濃度、不純物を識別するために 230 280 nm nm。 汚染物を除去、フェノール残基や DNA などカラム精製またはその後エタノールの洗浄および DNase 処理する RNA をクリーンアップします。注:この時点で、RNA RNAseq 分析のために送信する準備ができているまたは RT qPCR (詳細についてはセクション 3.1 を参照) に使用する cDNA を作るに使用することができます。RNA は、さらに使用するまで-80 ° C で保存できます。 とおり DNA を分離します。 チューブ B のピンクの有機相及び管内 B2、サンプルからある場合はインバージョンによる 100% のエタノールとミックスの 300 μ L を追加することによって、DNA を沈殿させます。2-3 分間常温、尿管を残します。 管 B、B2 375 x gペレット DNA への 4 ° C で 5 分間遠心します。 新しい 2 mL 管 (管 C) にそれを注ぐことによってチューブ B、B2 から上澄みを移動し、後続の蛋白質の隔離のための氷にそれを残します。チューブ B または B2 1 mL の 0.1 M クエン酸ナトリウム 4 ° C で 5 分間 375 x gで 30 分遠沈管 B、B2 の 10% エタノールによる DNA の餌を洗う注:ナトリウムは、クエン酸ナトリウム、エタノール、低速遠心分離によって除去される不純物を許可する DNA をより容易に沈殿物作る DNA のバックボーンにバインドします。 2.6.3 の手順で説明するように、洗浄手順を繰り返します。75% のエタノールの 1.5 mL にペレットを再懸濁し、upending によって時折混合 20 分間常温放置します。 4 ° C で 5 分間 375 × gで遠心チューブ B と B2 上澄みを廃棄し、5-10 分間乾燥すること。 8 mM 水酸化ナトリウムを 150 μ L でペレットを溶解します。必要に応じて、HEPES を目的の pH に調整します。4 ° C で 5 分間 375 x gでサンプルをスピンします。 マイクロ ピペットを使用して、新しいチューブに上清 (DNA) を移動します。濃度を測定し、分光光度計を使用して純度を決定します。260 で吸光度を記録 DNA 濃度の不純物を識別するために 230 と 280 nm nm。 とおりタンパク質を分離します。 蛋白質の沈殿物にチューブ C、数回反転によるミックスのピンクの上澄みに 100% イソプロパノールの最大 1.5 mL を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。 4 ° C で 10 分間 13,500 x gで C 管を遠心分離します。 上澄みを廃棄し、4 ° C で 5 分間 5,300 × gで RT。 遠心管 C で 20 分の 95% エタノールで 0.3 M グアニジン塩酸 2 mL にペレットを洗う 2.7.3 の手順で説明するように洗浄手順を繰り返します 2 倍。 蛋白ペレットを新しい 1.5 mL チューブ (管 C2) に移動し、95% のエタノールの最大 1.5 mL を追加します。渦と RT で 20 分待ちます。 チューブ C2 4 ° C で 5 分間 5,300 × gで遠心分離します。上澄みを廃棄し、乾燥したディゾルブで 10 分の 60 分の 50 ° c 5 %sds の 300 μ L でペレット ペレット。注: 長いインキュベーション時間は蛋白ペレットを完全に溶解する必要があります。過去には、ペレットは、品質を損なうことがなく 6 h までの培養されています。 チューブ C2 13,500 x g 17 ° C で 10 分間遠心します。上清を新しいチューブに移動します。 洗剤と互換性のある好ましい蛋白質定量アッセイを使用して濃度を測定します。注:蛋白質は SDS のページおよび西部にしみが付くことで使用する準備ができて。それは、将来の使用のための-20 ° C で保存できます。LC ・ MS/MS などの他の技術の洗剤を透析する必要があります。 3. mRNA および蛋白質レベルの評価 RT qPCR 1 の逆のトランスクリプションによって cDNA を準備次たちのプロトコルを使用して RNA の ng: 逆のトランスクリプション (46 ° C で 20 分)、そして RT 不活性化 (95 ° c 1 分) (25 ° c 5 分) をプライミングします。 96 ウェル プレートの個々 の井戸への各 cDNA サンプルの 1: 100 希釈液 100 μ L の追加によって cDNA のストック プレートを作る。ないのテンプレート/水専用の井戸、希釈したサンプル 1:25 から 1: 400 (すべての分析サンプルからプールされた cdna 由来) などの適切なコントロールは、標準曲線分析各遺伝子のプライマー効率を確立するを許可します。注:この形式は、96 ウェル microdispenser、ウェル ウェル分注バリエーションの軽減、RT qPCR プレートにプレートのすべてのサンプルを転送するを可能にすると使用できます。マルチ チャンネル ピペットを適切なマスター ミックス (例えば、SYBR + プライマー) それぞれにもその後、追加できます。全体的にみて、このアプローチは手ピペッティング各サンプルでは、このようにさらに可変性を減らすときの誤差を低減します。 ストック プレートから RT qPCR プレートの井戸に cDNA の 3 μ L を追加します。 転送し、逆にプライマー、サンプルあたり最大 7 μ L を水 1 x スーパーミックス DNA 間をインターカ レート シアニン色素の 5 μ を含むを含むプライマーの各セットのマスター ミックスを作る。RT qPCR 板の適切な井戸を 7 μ L を追加し、ミックスに軽く揺り動かします。注:20の結果を正規化するための参照として使用するハウスキーピング遺伝子を測定するサンプルが含まれます。 使用されているプライマーに適した Rt-qpcr プロトコルを使用してプレートを実行します。 西部のしみ注:西部のしみの詳細については、マフムードと陽の21を参照してください。 2 倍の塩化物イオンとサンプル バッファーと 95 ° C, 10 分で沸騰の等量と蛋白質の 20 μ g を組み合わせることにより SDS ページのサンプルを準備します。 4-15% トリス-グリシンのゲルにサンプルをロードし、150 V、1 時間または染料前ゲルの下端に到達するまでにそれらを実行します。 セミドライの転送装置で 30 分間 25 V でニトロセルロース膜にゲルからタンパク質を転送します。 Ponceau S 染色で膜の汚損によって適切な転送を確認します。 トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 0.01% ポリソルベート 20 (TBS-T) と膜から汚れを徹底的に洗います。 室温 1 時間 TBS t 5% 乳脂肪の膜をブロックします。 供給者の勧告に従って適切な希釈で一次抗体で膜を孵化させなさい。4 ° C でロッカーに一晩置いておきます。 洗浄、3 x、5 分ごとに、TBS”T”で 供給者の勧告に従って適切な希釈で適切な二次抗体の膜を孵化させなさい。室温 1 時間ロッカーにそれを残す 洗浄、3 x、5 分ごとに、TBS”T”で イメージして推奨される方法を使用して西部のしみを定量化します。