线虫的核苷酸和蛋白质提取联合

请注意:每个大分子沉淀步骤按顺序进行, 然后同时进行洗涤;但是, 建议先完成 RNA 隔离, 因为它本质上是不稳定的。 1. 样品收集 种子 1, 000个蠕虫蛋每10厘米板材以适当的成长情况19。在20°c 下孵化72小时。请注意:漂白生育鸡蛋的成年人为了收集鸡蛋, 如前面所述的 19。 用约5毫升的 ML 缓冲液清洗盘子, 并将 1, 000只成年蠕虫收集到一个管中。请注意:MM 缓冲液由 35 mM 磷酸钠二基、102 m 氯化钠、22 mM 磷酸二甲酸钾和 1 mM 硫酸镁在无菌水中组成19。 以 1, 000 x克的速度离心蠕虫, 将上清液丢弃, 并将带有1毫升 mL 缓冲液的颗粒蠕虫转移到 1.5 ml 的微离心管中。 再次离心在 845 x 克 1分钟, 并丢弃大部分上清液。将颗粒蠕虫存放在-80°c, 至少4小时。请注意:使用冷冻颗粒比新鲜颗粒产生更高的产量。建议在干冰上使用液氮或95% 乙醇进行一系列冻融循环, 以破解蠕虫角质层。在颗粒上留下少量的 M9 将有助于在冷冻时打破角质层。 2. 核苷酸和蛋白质分离 从解冻的颗粒中取出任何上清液, 加入1毫升冷 GTCp 试剂。通过上下移液很好地混合。将样品放在冰上 10分钟, 然后通过倒置偶尔混合。注意事项:苯酚具有腐蚀性、神经毒性和剧毒, 可能导致化学烧伤和失明。请注意:我们使用了多达 5, 000只成年蠕虫作为起始材料与报告的体积;每个卷是基于使用1毫升的 GTCp 试剂。使用较大的样品时, 可能需要向上扩展。 在蠕虫和 GTCp 溶液中加入200Μl 的冷氯仿。将管子夹在手指之间, 用力摇晃 15秒, 在室温 (RT) 下保持3分钟。注意事项:氯仿是一种有毒的刺激物, 可能会引起皮肤溃疡和其他器官靶向伤害, 是一种可能的致癌物质。 在4°c 条件下, 以 13, 500 x g离心管15分钟。请注意:在这个自旋后形成三个层: 顶部, 清澈的水相, 底部, 粉红色的有机相, 和小的, 多云的中间相, 包含脂质和 DNA。 使用微移液器, 将透明顶层 (水相) 移动到新的无 rnase 1.5 mL 微离心管 (管 a), 通过酒精沉淀分离 rna (如步骤2.5 中详细说明), 并将粉红色层 (有机相) 从剩余的颗粒移动到新的管 (管 B), 并把它放在冰上。请注意:粉红色的有机相可以在-80°c 下冷冻, 直到从这个样本中分离出 DNA 和蛋白质。较大的样品将在水相和有机相之间产生厚厚的白色层。这个分数包含 DNA。如果可以在不干扰其他阶段的情况下去除这一层, 请这样做, 并将其放入单独的管 (管 B2) 中。 将 RNA 隔离如下。 从 A 管中清澈的水相中沉淀 RNA, 用500μl 的100% 异丙醇沉淀。在 RT 孵化10分钟。然后, 离心管 A 在 13, 500 x g下 10分钟, 在4°c。请注意:在试管底部应该可以看到一个白色的小颗粒。 装饰大部分的上清液。用针头用1毫升注射器取出其余的, 并丢弃上清液。请注意:针头的大小并不重要;然而, 一个更大的针表将提供更多的控制, 以避免干扰颗粒。如果没有针头, 可以使用微型移液器。 在 a 管中加入1毫升75% 的乙醇来清洗颗粒。在4°c 下, 以 5, 300 x g旋转管5分钟。 如步骤2.5.2 所述, 通过脱皮和使用带针头的1毫升注射器将上清液从颗粒中取出, 并将其丢弃。 让颗粒风干 5-10分钟, 但不要让它过度干燥。在 rna 颗粒完全透明之前, 使用50Μl 的无 rnase 水重建 RNA 颗粒。请注意:这是1000–3000蠕虫的足够启动量, 但可能需要根据使用的起始材料的数量进行调整。 在55–60°c 下将颗粒培养10分钟以溶解。 使用分光光度计测量浓度和纯度。记录吸收率为260纳米, 用于 rna 浓度, 并记录在230和280纳米的吸收率, 以识别任何杂质。 通过色谱柱纯化或随后的乙醇清洗和 DNASE 处理, 清除 rna 以去除任何污染物, 如苯酚残留物或 Dna。请注意:此时, RNA 已准备好用于 RNAseq 分析, 也可用于使 cDNA 用于 RT-qPCR (详见第3.1 节)。RNA 可储存在-80°c, 直到进一步使用。 分离 DNA, 如下所示。 从 B 管中的粉红色有机相和 B2 管中的样品中, 如果有的话, 通过添加300Μl 的100% 乙醇并通过倒置混合来沉淀 DNA。将地铁在 RT 处停留2-3分钟。 在4°c 条件下, 以 375 x g 离心 b 和 B2管, 5分钟, 以颗粒 dna。 将上清液从 B 管和 B2 中移, 将其倒入新的2毫升管 (C 管) 中, 并将其留在冰上进行随后的蛋白质分离。用1毫升 0.1 m 柠檬酸钠在10% 乙醇中清洗 b 或 B2 中的 Dna 颗粒 30分钟. 在4°C 下, 在375xg 处, 用 b 管和 B2管清洗5分钟。请注意:钠与 DNA 主干结合, 使 DNA 在柠檬酸钠和乙醇中更容易沉淀, 从而通过低速离心去除杂质。 按照步骤2.6.3 中的说明重复清洗步骤。将颗粒在75% 乙醇的 1.5 mL 中重新使用, 并将其保留在 RT 20分钟, 偶尔通过向上混合。 在4°C 下, 以 375 x g 离心管 B 和 B2 5分钟。 丢弃上清液, 让其干燥5-10分钟。 溶解颗粒在150μl 的 8 Mm 氢氧化钠。如有必要, 使用 HEPES 调整到所需的 pH 值。在4°c 下将样品以 375 x g旋转5分钟。 使用微移液器, 将上清液 (DNA) 移动到一个新的管。使用分光光度计测量浓度并确定纯度。记录 DNA 浓度为260纳米, 在230和280纳米时记录吸收率, 以识别任何杂质。 分离蛋白质如下。 为了沉淀蛋白质, 在 c 管中的粉红色上清液中加入高达 1.5 mL 的100% 异丙醇, 通过多次倒置混合, 并在 RT 孵育10分钟。 在 13, 500 x g 的离心管 c, 在4°c 下10分钟。 在 RT 中, 在 5300 x g 的离心管 c 中, 在4°c 下用2毫升 0.3 m 鸟嘌呤盐酸2毫升的颗粒在 rt 离心管 C 中清洗 20分钟, 5分钟。 按照步骤 2.7.3 2x 中的说明, 重复清洗步骤。 将蛋白质颗粒移动到新的 1.5 mL 管 (C2 管), 并将95% 的乙醇加起来达到 1.5 mL。漩涡, 让它坐在 RT 20分钟。 离心管 C2 在 5, 300 x g下 5分钟, 在4°c 下。丢弃上清液, 让颗粒在 RT 干燥 10分钟, 在50°c 下溶解500Μl 中的颗粒, 在50°C 下干燥60分钟。注: 可能需要更长的孵育时间才能完全溶解蛋白质颗粒。过去, 颗粒在不牺牲质量的情况下孵育长达6小时。 在 13,500 x g 的离心管 C2, 在17°c 下 10分钟. 将上清液移到新管上。 使用与洗涤剂兼容的首选蛋白质定量检测方法测量浓度。请注意:该蛋白可用于 SDS-PAGE 和西方印迹。它可以存储在-20°c, 供将来使用。对于其他技术, 如 LC-MSMS, 洗涤剂将需要透析关闭。 3. 评估 mRNA 和蛋白质水平 RT-qPCR 使用以下热环素协议, 用1纳气的 rna 逆转录酶进行逆转录酶制备 cDNA: 启动 (25°c 时 5分钟)、逆转录酶 (46°c 时 20分钟) 和 RT 失活 (95°c 时 1分钟)。 在96孔板的单个井中加入100μl 的1:100 稀释剂, 制作一个 cDNA 的股票板。包括适当的控制, 如没有只有温度的井, 以及从1:25 到1:400 的连续稀释样品 (源自所分析的所有样本中的集合 cDNA), 以便为所分析的每个基因建立一个标准曲线, 建立引信效率。请注意:这种格式可与96井微分配器一起使用, 它允许将板中的所有样品转移到 RT-qPCR 板, 并减少井到井移液的变化。此后, 可以使用多通道移液器将适当的主组合 (例如 SYBR + 引物) 添加到每口井中。总体而言, 这种方法减少了手工移液每个样品时出现的错误, 从而进一步减少了可变性。 从股票板中加入3μl 的 cDNA 到 RT-qPCR 板的井中。 对每套引物进行主混合, 其中包括1x 的超级混合物, 其中包含 dna 插层氰化物染料, 每个正向和反向引物为 5μm, 每个样品的水最高为7Μl。在 RT-qPCR 板的适当井中加入 7μl, 轻轻搅拌混合。请注意:包括样本来测量家务基因, 作为参考, 使结果正常化 20。 使用适用于所使用引物的 RT-qPCR 协议运行板。 西方污点请注意:有关西方印迹的详细信息, 请参阅马哈茂德和杨21。 将20μg 的蛋白质与相同体积的 2x Laemmli 样品缓冲器结合起来, 在95°c 下煮沸 10分钟, 为 SDS-PAGE 准备样品。 将样品装入 4%–15% 的弗里斯-甘氨酸凝胶, 并以 150 V 的速度运行 1小时, 或者直到染料前部到达凝胶底部。 在半液转移装置中, 将蛋白质从凝胶转移到 25 V 的硝化纤维素膜30分钟。 用 Ponceau S 染色染色, 确认膜的正确转移。 用0.01% 的聚山梨酸盐 20 (TBS-T) 彻底清洗膜上的污渍。 在 trt 用5% 的脱脂牛奶在 TBS-T 中阻止膜1小时。 根据供应商的建议, 在适当的稀释下对原代抗体中的膜进行培育。将其放置在4°c 的摇杆上过夜。 用 TBS-T 清洗膜 3倍, 每次5分钟。 根据供应商的建议, 在适当的稀释下将膜在适当的二级抗体中进行培育。把它放在 RT 的摇杆上1小时。 用 TBS-T 清洗膜 3倍, 每次5分钟。 图像和量化西方污点, 使用首选的方法。