Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-

La disponibilidad de recursos hídricos (es decir, precipitación, contenido de agua del suelo) determina estrictamente la mortalidad y la distribución geográfica de las especies vegetales, ya que necesitan absorber el agua del suelo y transportarla a las hojas para la producción fotosintética. Las plantas deben mantener su sistema de transporte de agua bajo suministros de agua fluctuantes. En particular, las plantas leñosas generan altas tensiones en sus conductos a lo largo de los arroyos de transpiración, ya que, en algunos casos, necesitan sostener su corona más de 100 m sobre el suelo. Para mantener las columnas de agua bajo tan alta presión negativa, los conductos de xilema consisten en un continuo de células tubulares con paredes celulares rígidas e hidrofóbicas-lignificadas¹. La vulnerabilidad a la disfunción xilema de los conductos de xilema en cada especie es un buen determinante de la supervivencia de la especie bajo el suministro de agua fluctuante². Además, el estudio del estado del agua de los conductos de xilema es importante para la evaluación de la condición de salud de los árboles individuales sometidos a tensiones abióticas o bióticas. La medición del flujo de savia o del potencial hídrico puede proporcionar estimaciones del estado del agua de una planta leñosa debido a la función hidráulica integrada de los conductos de xilema. Además, la visualización de la distribución de agua en células xilem puede aclarar el estado de los componentes individuales del sistema hidráulico xilema.

Existen varias técnicas para visualizar el estado del agua de los conductos de xilema³. Los métodos clásicos y útiles para observar las vías del agua en el tejido leñoso implican la tinción de la columna de agua sumergiendo los extremos de las ramas cortadas en un tinte o inyectando un tinte en los tallos de los árboles de pie⁴. La fotografía de rayos X suave también permite la visualización de la distribución de agua de discosde madera en rodajas debido a la intensidad diferencial de absorción de rayos X de la humedad en xylem 5,^6. Estos métodos, sin embargo, sólo proporcionan pistas de movimiento del agua o demuestran distribuciones macroscópicas de agua. Recientemente, técnicas de observación no destructivas, tales como la tomografía computarizada por rayos X de microfoco (CT)^7,8,9,10y la resonancia magnética (RM)^{11, 12}, se han mejorado significativamente para permitir la observación del agua en conductos de xilema dentro de los árboles intactos. Estos métodos no destructivos tienen grandes ventajas en el que podemos observar el estado del agua del xilema sin efectos de corte artificiales, y podemos rastrear la dinámica del flujo de agua mediante imágenes secuenciales o introduciendo un agente de contraste¹⁰. Sin embargo, necesitamos utilizar una resonancia magnética personalizada para la toma de imágenes de plantas o una instalación especializada para la ctuta ción basada en sincrotrón con el fin de obtener las imágenes que pueden identificar el contenido de agua a nivel celular. Además, aunque el sistema de caños basado en sincrotrón permite obtener imágenes finas con alta resolución espacial, que es comparable a la microscopía de luz^7,8,9, las células vivas pueden ser lesionadas por el radiación de rayos X de alta energía^13,14. El uso de un microscopio electrónico de barrido en el que se instalan criounidades (crio-SEM) es un método muy útil para localizar con precisión el agua en xilema a nivel celular, aunque esto requiere la recolección destructiva de la muestra para la observación. Para fijar el agua en conductos de xilema, una parte de los tallos (es decir, ramas, ramas o tallos) se congelan in situ por nitrógeno líquido (LN₂). Las observaciones de la superficie de los especímenes recortados y congelados por crio-SEM proporcionan imágenes altamente magnificadas de la estructura xilema a partir de las cuales podemos identificar el agua en conductos de xilema como hielo. Una limitación significativa de este método es que la observación secuencial de la movilidad del agua dentro de la misma muestra es imposible. Sin embargo, la aplicación de la “CT” o de la RMN para la observación secuencial de los árboles que viven en un campo es extremadamente difícil porque estos instrumentos no son portátiles. Por el contrario, crio-SEM tiene un potencial para utilizar esta técnica en árboles grandes en experimentos de campo para visualizar claramente el contenido de agua no sólo a nivel celular, sino también a un nivel de estructura más fino, por ejemplo, agua en pozos intervasculares¹⁵, agua en espacios intercelulares^16,o burbujas en la columna de agua^17.

Muchos estudios observando el agua xilema por crio-SEM se han reportado ^{5,12,18,19,20,21,23}. (1996) establecieron inicialmente el protocolo de observación del xilema in situ mediante la liofilización de un tronco vivo mediante el llenado de LN₂ en un recipiente situado en el tallo^21. La temperatura de la muestra se mantuvo por debajo de -20 oC durante la recolección de la muestra y durante la preparación crio-SEM con el fin de evitar el derretimiento del hielo dentro de los conductos de xilema. Este método se ha utilizado para observar el agua en xilema con el fin de aclarar la distribución del agua bajo el régimen cambiante de agua^{11,12,24,25,26, 27,28}, la variación estacional de la distribución de agua^21,29,30, el efecto de los ciclos de congelación-descongelación^{17,31, 32}, la distribución de agua en madera húmeda⁵, cambios en la distribución del agua durante la transición de la madera de savia a la madera de samanjística²⁰, curso de tiempo estacional de la actividad cambiaria y diferenciación de los vasos³³, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas^23,34. También se ha verificado la conductividad hidráulica y la vulnerabilidad de los conductos a la cavitación utilizando crio-SEM^35,36. Cryo-SEM equipado con espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDX o EDS) se ha utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de un espécimen que contiene agua^37.

La congelación de un tronco vivo que contiene conductos bajo alta tensión hidráulica a veces provoca cavitaciones artificiales que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo fracturados en el lumen de los conductos^38,39. En particular, las especies de hojas anchas con conductos más largos y anchos son vulnerables a artefactos inducidos por la tensión, como la cavitación causada por el corte de muestras, incluso si se llevan a cabo bajo el agua^3,40. Los artefactos de cavitación se vuelven visibles después del muestreo de un árbol transpirante (es decir, muestreo durante el día) o en condiciones severas de sequía y pueden inducir a error a una sobreestimación de la ocurrencia de cavitación^{3,38, 39}. Por lo tanto, la tensión que funciona en los conductos tiene que ser liberada con el fin de evitar la cavitación artifreal^3,12,39.

La técnica de fractura por congelación utilizando un cuchillo instalado en una cámara de muestras se emplea a menudo para exponer la superficie de la muestra para la observación crio-SEM. Sin embargo, los planos fracturados por congelación de los tejidos vegetales leñosos, especialmente las seccionestransversales del xilema secundario, son demasiado ásperos para observar claramente las características anatómicas y el agua en el tejido 6. La aplicación de un criostato para recortar una muestra permite una preparación rápida y de alta calidad de las superficies de la muestra^20,23. El objetivo general de este método es proporcionar evidencia con resolución de microscopía electrónica de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ sin la ocurrencia de artefactos de muestreo. Presentamos nuestro procedimiento actualizado, que se ha mejorado constantemente desde que lo adoptamos por primera vez, en relación con el muestreo, recorte y limpieza de la superficie de la muestra para obtener micrografías electrónicas de alta calidad de muestras criofijas de xilema.