Cryo-scanning Electron mikroskop ile görselleştirilen Woody bitkilerde xylem su dağılımı
Summary
Körte su dağılımının gözlemlenmesi, odunsu bitkilerde suyun akış dinamikleri ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Bu çalışmada, örnek hazırlama sırasında su durumundaki artifaktüel değişiklikleri ortadan kaldıran bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ ‘da xylem su dağıtımını gözlemlemek için pratik bir yaklaşım gösteririz.
Abstract
Bir tarama elektron mikroskop yüklü Kriyo-birimi (Cryo-SEM) Subzero sıcaklıklarda numune gözlem sağlar ve sıvı nitrojen kullanarak dondurma fiktasyon teknikleri ile birlikte bitki dokularında su dağıtımı keşfetmek için kullanılmıştır (LN 2). odunsu türler için, ancak, xylem enine kesme yüzeyi gözlem hazırlıkları ahşap liflerin oryantasyonu nedeniyle bazı zorluklar içerir. Ayrıca, xylem kanallarının su sütununda daha yüksek gerilim, özellikle örnek fiktasyon ve toplama sırasında su dağıtımında artifaktüel değişikliklere neden olabilir. Bu çalışmada, bir kriyostat ve Cryo-SEM kullanarak situ ‘daki odunsu bitkilerin xylem içerisindeki suyun dağılımını gözlemlemek için etkili bir prosedür sergiliyoruz. İlk başta, numune toplama sırasında, xylem su potansiyelinin ölçülmesi, xylem kanalında yüksek gerilimin bulunup bulunmadığını belirlemelisiniz. Xylem su potansiyeli düşükken (< CA. − 0,5 MPa), numune dondurulması sırasında xylem kanallarında su durumunun daha iyi korunmasını kolaylaştırmak için bir gerginlik rahatlama prosedürü gereklidir. Sonra, bir su geçirmez yaka ağaç kökü etrafında eklenir ve LN ile dolu2 xylem su durumunun donması için sabitleme. Hasat sonrası, örnek gözlem için numune hazırlama prosedürlerini tamamlarken numunenin donmuş şekilde korunduğundan emin olmak için bakım alınmalıdır. Xylem enine kesilmiş yüzeyi açıkça açığa çıkarmak için bir kriyostat kullanılmaktadır. Cryo-SEM gözlemlerde, donma-aşındırma için zaman ayarlaması, Frost tozunu kaldırmak ve izleme yüzeyinde hücre duvarlarının kenarını vurgulamak için gereklidir. Sonuçlarımız, hücresel ve hücre altı seviyelerinde xylem içinde su dağılımı gözlem için Cryo-SEM tekniklerinin uygulanabilirliğini göstermektedir. Cryo-SEM ile tahribatsız in situ gözlem teknikleri ile kombinasyonu derin odunsu bitki suyu akış dinamiklerinin keşfi geliştirmek olacaktır.
Introduction
Su kaynaklarının kullanılabilirliği (yani, yağış, toprak suyu içeriği) kesinlikle bitki türlerinin mortalite ve coğrafi dağılımını belirler, çünkü topraktan su absorbe etmek ve fotosentetik üretim için yaprakları taşımak gerekir. Bitkiler su taşıma sistemini dalgalanan su kaynakları altında tutmalıdır. Özellikle, odunsu bitkiler, bazı durumlarda, onların taç daha ~ 100 m zemin üzerinde tutmak gerekir gibi transpirasyon akışları boyunca kendi kanallarında yüksek gerginlik üretir. Bu kadar yüksek negatif basınç altında su sütunları korumak için, xylem kanallar sert ve hidrofobik-lignified hücre duvarları ile tübüler hücrelerin bir süreklilik oluşur1. Her türün xylem boru disfonksiyonunun xylem bozukluğu için güvenlik açığı, dalgalanan su kaynağı altında türlerin hayatta kalmasının iyi bir belirleyici olduğunu2. Buna ek olarak, xylem kanallarının su durumunun incelenmesi, Abiotik veya biyotik gerilmelere maruz kalan ayrı ağaçların sağlık durumunun değerlendirilmesi için önemlidir. SAP akışını veya su potansiyelini ölçmek, xylem kanallarının Entegre hidrolik fonksiyonu nedeniyle odunsu bir bitkinin suyun durumunun tahminlerini sağlayabilir. Ayrıca, xylem hücrelerinde suyun dağılımını görselleştirerek xylem Hidrolik sisteminin bireysel bileşenlerinin durumunu açıklığa kavuşturabilirsiniz.
Xylem kanallarının su durumunu görselleştirmeye yarayan çeşitli teknikler var3. Ahşap doku su yolları gözlemleme için klasik ve yararlı yöntemler bir boya içine kesim dalları uçları daldırarak veya ayakta ağaca bir boya enjekte ederek su sütunu boyama içerir4kaynaklanıyor. Soft x-ışını fotoğrafçılığı, xylem5,6‘ da nem diferansiyel x-ışını emilimi yoğunluğu nedeniyle dilimlenmiş ahşap diskler su dağılımı görselleştirme sağlar. Bu yöntemler, ancak, sadece su hareketi parçaları sağlamak veya su makroskopik dağılımları göstermek. Son zamanlarda, mikro odaklama X-Ray bilgisayarlı tomografi (μct)7,8,9,10ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)11 gibi tahribatsız gözlem teknikleri, 12, önemli ölçüde sağlam fidanlar içinde xylem kanallar su gözlem sağlamak için geliştirilmiştir. Bu yıkıcı olmayan yöntemler biz yapay kesme efektleri olmadan xylem su durumunu gözlemlemek ve biz ardışık görüntüleme veya bir kontrast Ajan10tanıtmak su akışı dinamikleri izleyebilirsiniz büyük avantajları vardır. Ancak, hücresel düzeyde su içeriğini tanımlayabilen görüntüleri elde etmek için bitki görüntüleme veya Synchrotron tabanlı μCT için özel bir tesis için özelleştirilmiş bir MRI kullanmanız gerekir. Buna ek olarak, Synchrotron tabanlı μct sistemi, ışık mikroskobu7,8,9ile karşılaştırılabilir yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip ince görüntüler elde etmek için etkin olsa da, yaşam hücreleri tarafından yaralanabilir yüksek enerji X-ışını13,14radyasyon. Hangi Cryo-birimleri yüklü bir tarama elektron mikroskop istihdam (Cryo-SEM) tam bir hücresel düzeyde xylem su bulmak için çok yararlı bir yöntemdir, bu yıkıcı gözlem için örnek hasat gerektirir rağmen. Xylem kanalları su düzeltmek için, (yani, dallar, dalları veya kaynaklanıyor) kaynaklanan bir kısmı sıvı nitrojen (LN2) tarafından situ dondurulmuş. Cryo-SEM tarafından kesilmiş, dondurulmuş numunelerin yüzeyinin gözlemleri, biz buz olarak xylem kanallarının su tanımlayabilir hangi xylem yapısının yüksek büyütülmüş görüntüler sağlar. Bu yöntemin önemli bir sınırlama, aynı numune içinde su taşınabilirlik sıralı gözlem imkansız olmasıdır. Ancak, bu aletler taşınabilir olmadığından bir alanda yaşayan ağaçların sıralı gözlem için μCT veya MRI uygulaması son derece zordur. Buna karşılık, Cryo-SEM açık bir şekilde sadece hücresel düzeyde değil, aynı zamanda daha ince bir yapı düzeyinde su içeriğini görselleştirmek için alan deneylerinde büyük ağaçlar bu tekniği kullanarak bir potansiyele sahiptir, örneğin, intervasküler çukurlarda su15, su içinde hücre içi alanlar16, veya su sütununda Bubbles17.
Cryo-SEM tarafından xylem su gözlem birçok çalışmalar bildirilmiştir 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ve ark. (1996) başlangıçta bir konteyner içine kök21üzerine set içine LN2 doldurma yoluyla bir yaşam gövdesinin dondurma-fiksasyonu ile situ içinde xylem gözlem için protokol kuruldu. Numune toplama sırasında ve Cryo-SEM hazırlığı sırasında, kıt kanallarının içindeki buzu erime önlemek amacıyla, numunenin sıcaklığı-20 °C ‘ nin altında tutulur. Bu yöntem, değişen su rejimi11,12,24,25,26, altında su dağılımı açıklığa kavuşturmak için xylem su gözlemlemek için kullanılmıştır 27,28, su dağıtımı mevsimsel varyasyonu21,29,30, Freeze-çözülme döngüleri etkisi17,31, 32, ıslak ahşaptan su dağılımı5, diri odun ‘dan kalp ağacından20‘ ye geçiş sırasında su dağıtımında değişiklikler, cambial aktivite ve damarları33farklılaşma mevsimsel zaman ders, ve kavitasyon bazı biyotik gerilimler tarafından indüklenen23,34. Hidrolik iletkenlik ve boruları kavitasyon için güvenlik açığı da Cryo-SEM35,36kullanılarak doğrulandı. Enerji Dispersif X-ışını spektrometresi (EDX veya EDS) ile donatılmış Cryo-SEM, su37içeren bir numunenin yüzeyi üzerinde eleman dağılımını incelemek için kullanılmıştır.
Yüksek hidrolik gerginlik altında kanallar içeren bir yaşam gövdesinin donma-fiktasyonu bazen Cryo-SEM ‘ i hangi boru hatlarının lümeninde kırık buz kristalleri tarafından gözlenen yapay kavimlere neden olur38,39. Özellikle, daha uzun ve daha geniş kanallara sahip geniş türler, su3,40altında yürütülse bile, numune kesiminin neden olduğu kavitasyon gibi gerginlik kaynaklı eserler için savunmasız. Kavitasyon eserler bir nirengi ağacının örnekleme sonra göze çarpan olur (yani, gün boyunca örnekleme) veya şiddetli kuraklık koşulları altında ve kavitasyon oluşumu bir aşırı tahmin yanıltabilir3,38, 39. Bu nedenle, borular içinde çalışan gerginlik artifaktüel kavitasyon önlemek için serbest bırakılmalıdır3,12,39.
Bir numune odasına takılı bir bıçağı kullanan donma-kırılma tekniği genellikle Cryo-SEM gözlem için numune yüzeyini açığa çıkarmak için kullanılmaktadır. Ancak, odunsu bitki dokularının Freeze-kırık uçaklar, ikincil xylem özellikle enine bölümleri, doku6anatomik özellikleri ve suyu açıkça gözlemlemek için çok kaba. Bir numunenin kırpması için bir kriyostat uygulaması, örnek yüzeylerin hızlı ve yüksek kalitede hazırlanması20,23sağlar. Bu yöntemin genel hedefi, numune alma oluşumları olmadan situ ‘daki çeşitli Ksilem hücrelerinde su dağılımının Elektron Mikroskopisi çözünürlüğüne sahip kanıt sağlar. Biz ilk kabul beri sürekli olarak geliştirilmiş olan güncel prosedürü tanıtmak, örnekleme ile ilgili, kırpma ve yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için numune yüzeyi Temizleme xylem Cryo-sabit numuneler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda sunulan Cryo-SEM gözlem yöntemleri, hücresel ölçekte su dağıtımını açıkça görselleştirmeye yönelik pratiktir. Bu yöntem sayesinde, xylem içinde su dağılımı değişiklikleri keşfetmek potansiyel abiyotik stres (su sıkıntısı veya donma) veya biyotik stres (ağaç hastalığı) ağaç türlerinin toleransı mekanizması açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir.
Bu yöntemde en önemli adım, numune toplama ve sonraki numune hazırlama sırasında yerel …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma JSPS KAKENHI tarafından desteklenmektedir (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
