Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

La disponibilità di risorse idriche (ad esempio, precipitazioni, contenuto di acqua del suolo) determina rigorosamente la mortalità e la distribuzione geografica delle specie vegetali, poiché devono assorbire l’acqua dal suolo e trasportarla alle foglie per la produzione fotosintetica. Gli impianti devono mantenere il loro sistema di trasporto idrico sotto l’approvvigionamento idrico fluttuante. In particolare, le piante legnose generano alte tensioni nei loro condotti lungo i corsi d’acqua di traspirazione in quanto, in alcuni casi, hanno bisogno di tenere la corona a più di 100 m da terra. Per mantenere le colonne d’acqua sotto una pressione negativa così elevata, i condotti xylem consistono in un continuum di cellule tubolari con pareti cellulari rigide e lofobiche-lignifiche¹. La vulnerabilità alla disfunzione xylem dei condotti xylem in ogni specie è un buon determinante della sopravvivenza delle specie sotto l’approvvigionamento idrico fluttuante². Inoltre, lo studio dello stato dell’acqua dei condotti xylem è importante per la valutazione delle condizioni di salute dei singoli alberi sottoposti a stress abiotico o biotico. La misurazione del flusso di linfa o del potenziale idrico può fornire stime dello stato dell’acqua di un impianto legnoso a causa della funzione idraulica integrata dei condotti xylem. Inoltre, la visualizzazione della distribuzione dell’acqua nelle cellule xiliere può chiarire la condizione dei singoli componenti del sistema idraulico xylem.

Diverse tecniche per visualizzare lo stato dell’acqua dei condotti xylem esistono³. I metodi classici e utili per osservare le vie dell’acqua nel tessuto legnoso comportano la colorazione della colonna d’acqua immergendo le estremità dei rami tagliati in un colorante o iniettando un colorante nei gambi degli alberi in piedi⁴. La fotografia a raggi X morbida consente anche la visualizzazione della distribuzione dell’acqua dei dischi di legno a fette a causa dell’intensità differenziale di assorbimento dei raggi X dell’umidità nello xilarem^5,6. Questi metodi, tuttavia, forniscono solo tracce di movimento dell’acqua o dimostrano distribuzioni macroscopiche di acqua. Recentemente, tecniche di osservazione non distruttiva, come la tomografia computerizzata a raggi X micro-fuoco (CT)^7,8,9,10e la risonanza magnetica (RM)^{11, 12}, sono stati notevolmente migliorati per consentire l’osservazione dell’acqua nei condotti xylem all’interno di alberelli intatti. Questi metodi non distruttivi hanno grandi vantaggi in quanto possiamo osservare lo stato dell’acqua dello xylem senza effetti di taglio artificiale, e possiamo monitorare le dinamiche del flusso d’acqua mediante imaging sequenziale o introducendo un agente di contrasto¹⁰. Tuttavia, dobbiamo utilizzare una risonanza magnetica personalizzata per l’imaging delle piante o un impianto specializzato per la TC a base di sincrotrone al fine di ottenere le immagini in grado di identificare il contenuto di acqua a livello cellulare. Inoltre, anche se il sistema CT basato sul sincrotrone ha permesso di ottenere immagini pregiate ad alta risoluzione spaziale, che è paragonabile alla microscopia leggera^7,8,9, le cellule viventi possono essere ferite radiazione di raggi X ad alta energia^13,14. L’impiego di un microscopio elettronico a scansione in cui sono installate crio-unità (crio-SEM) è un metodo molto utile per localizzare con precisione l’acqua nello xilem a livello cellulare, anche se questo richiede la raccolta distruttiva del campione per l’osservazione. Per fissare l’acqua nei condotti xylem, una parte dei gambi (ad esempio, ramoscelli, rami o steli) viene congelata in situ con azoto liquido (LN₂). Le osservazioni della superficie degli esemplari rifilati e congelati da crio-SEM forniscono immagini altamente ingrandite della struttura xylem da cui possiamo identificare l’acqua nei condotti xylem come ghiaccio. Una limitazione significativa di questo metodo è che l’osservazione sequenziale della movabilità dell’acqua all’interno dello stesso campione è impossibile. Tuttavia, l’applicazione di CT o RM per l’osservazione sequenziale di alberi che vivono in un campo è estremamente impegnativa perché questi strumenti non sono portatili. Al contrario, il crio-SEM ha il potenziale per utilizzare questa tecnica su grandi alberi negli esperimenti sul campo per visualizzare chiaramente il contenuto dell’acqua non solo a livello cellulare, ma anche a un livello di struttura più fine, ad esempio acqua nei pozzi intervascolari¹⁵, acqua in spazi intercellulari¹⁶, o bolle nella colonna d’acqua¹⁷.

Molti studi che osservano l’acqua xilem da crio-SEM sono stati segnalati ^5,12,^{18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) inizialmente stabilì il protocollo per l’osservazione dello xylem in situ con gelata di un tronco vivente tramite il riempimento di LN₂ in un contenitore impostato sul gambo²¹. La temperatura del campione è stata mantenuta al di sotto dei -20 gradi centigradi durante la raccolta del campione e durante la preparazione crio-SEM al fine di evitare lo scioglimento del ghiaccio all’interno dei condotti xylem. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l’acqua nello xilem al fine di chiarire la distribuzione dell’acqua in condizionando il regime idrico^{11,12,24,25,26, 27,28}, la variazione stagionale della distribuzione dell’acqua^21,29,30, l’effetto dei cicli di congelamento-scongelamento^{17,31, 32}, la distribuzione dell’acqua nel legno bagnato⁵, cambiamenti nella distribuzione dell’acqua durante il passaggio da sapwood a heartwood²⁰, corso di tempo stagionale di attività cambiale e differenziazione dei vasi³³, e cavitazione indotta da alcuni stress biotici^23,34. Anche la conduttività idraulica e la vulnerabilità dei condotti alla cavitazione sono stati verificati utilizzando crio-SEM^35,36. Cryo-SEM dotato di spettrometria a raggi X di dispersione energetica (EDX o EDS) è stato utilizzato per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua³⁷.

Fissazione del congelamento di un tronco vivente che contiene condotti sotto alta tensione idraulica a volte provoca cavitazioni artificiali che vengono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio fratturati nel lume dei condotti^38,39. In particolare, le specie a foglia larga con condotti più lunghi e larghi sono vulnerabili a manufatti indotti dalla tensione, come la cavitazione causata dal taglio del campione, anche se condotta sott’acqua^3,40. I manufatti di cavitazione diventano evidenti dopo il campionamento di un albero traspirante (cioè il campionamento durante il giorno) o in condizioni di siccità gravi e possono indurre in errore a soprastare l’occorrenza della cavitazione^{3,38, 39}. Pertanto, la tensione di lavoro nei condotti deve essere liberata per evitare la cavitazione artifactualiva^3,12,39.

La tecnica di congelazione con un coltello installato in una camera di campioni è spesso impiegata per esporre la superficie del campione per l’osservazione crio-SEM. Tuttavia, i piani congelato di tessuti vegetali legnosi, in particolare sezioni trasversali di xylem secondari, sono troppo ruvidi per osservare chiaramente le caratteristiche anatomiche e l’acqua nel tessuto⁶. L’applicazione di un criostato per il taglio di un campione consente una preparazione rapida e di alta qualità delle superfici campione^20,23. L’obiettivo generale di questo metodo è fornire prove con la risoluzione della microscopia elettronica della distribuzione dell’acqua in vari tipi di cellule xilime in situ senza la comparsa di artefatti di campionamento. Introduciamo la nostra procedura aggiornata, che è stata costantemente migliorata da quando l’abbiamo adottata per la prima volta, per quanto riguarda il campionamento, il taglio e la pulizia della superficie del campione per ottenere micrografie elettroniche di alta qualità di campioni crio-fissi di xilema.