Xylem water distributie in houtachtige planten gevisualiseerd met een Cryo-Scanning elektronenmicroscoop

Beschikbaarheid van watervoorraden (dat wil zeggen, neerslag, bodem waterinhoud) bepaalt strikt de sterfte en de geografische spreiding van plantensoorten, omdat ze nodig hebben om water te absorberen uit de bodem en het vervoer naar de bladeren voor fotosynthetische productie. De installaties moeten hun systeem van het watervervoer onder fluctuerende watervoorraden handhaven. In het bijzonder, bosrijke planten genereren hoge spanningen in hun leidingen langs de transpiratie stromen als, in sommige gevallen, ze nodig hebben om hun kroon te houden meer dan ~ 100 m boven de grond. Om water kolommen onder zulk hoge negatieve druk te handhaven, bestaan de Xylem leidingen uit een continuüm van tubulaire cellen met stijve en hydrofobe-lignified celwanden¹. De kwetsbaarheid voor Xylem dysfunctie van Xylem leidingen in elke soort is een goede determinant van de soorten overleving onder fluctuerende watervoorziening². Bovendien is het bestuderen van de water status van Xylem leidingen belangrijk voor de evaluatie van de gezondheidstoestand van individuele bomen die aan abiotische of biotische spanningen worden onderworpen. Het meten van SAP flow of water potentiaal kan schattingen geven van de water status van een bosrijke plant door de geïntegreerde hydraulische functie van Xylem leidingen. Bovendien kan het visualiseren van de distributie van water in Xylem cellen de conditie van individuele componenten van het Xylem hydraulisch systeem verduidelijken.

Verscheidene technieken om de water status van Xylem leidingen te visualiseren bestaan³. De klassieke en nuttige methoden voor het observeren van waterwegen in woody weefsel te betrekken kleuring de waterkolom door het onderdompelen van de uiteinden van de gesneden takken in een kleurstof of door het injecteren van een kleurstof in staande boom stengels⁴. Zachte x-ray fotografie maakt het ook mogelijk de visualisatie van het waterdistributie van gesneden hout schijven als gevolg van de differentiële x-ray absorptie intensiteit van het vocht in Xylem^5,6. Deze methodes, echter, verstrekken slechts sporen van water beweging of tonen macroscopische distributies van water aan. Onlangs, niet-destructieve observatietechnieken, zoals MicroFocus X-Ray computertomografie (µ CT)^{7, 8,9,10}en Magnetic Resonance Imaging (MRI)^{11, 12}, zijn significant verbeterd om observatie van water in Xylem leidingen binnen intacte jonge boompjes toe te staan. Deze niet-destructieve methoden hebben grote voordelen in dat we de water status van de Xylem kunnen observeren zonder kunstmatige snij effecten, en we kunnen water Stromingsdynamica volgen door sequentiële beeldvorming of een contrast agent¹⁰. Echter, we moeten gebruik maken van een aangepaste MRI voor plant Imaging of een gespecialiseerde faciliteit voor synchotron-based µ CT om de beelden die kunnen identificeren cellulaire niveau waterinhoud te verkrijgen. Bovendien, hoewel het synchotron-based µ CT-systeem in staat om fijne beelden te verkrijgen met een hoge ruimtelijke resolutie, die vergelijkbaar is met de Lichtmicroscopie^7,8,9, levende cellen kunnen worden verwond door de straling van hoge energie röntgenstraal^13,14. Gebruik maken van een Scanning elektronenmicroscoop waarin Cryo-units zijn geïnstalleerd (Cryo-SEM) is een zeer nuttige methode voor het nauwkeurig lokaliseren van het water in Xylem op een cellulair niveau, hoewel dit vereist destructief oogsten van de steekproef voor observatie. Om het water in Xylem leidingen vast te stellen, wordt een deel van de stengels (d.w.z. twijgen, takken of stengels) in situ bevroren door vloeibare stikstof (LN₂). Observaties van het oppervlak van getrimd, bevroren specimens door Cryo-SEM bieden sterk vergrote beelden van de Xylem structuur van waaruit we kunnen het water in Xylem leidingen als ijs te identificeren. Een significante beperking van deze methode is dat de opeenvolgende observatie van water beweeglijkheid binnen de zelfde steekproef onmogelijk is. Nochtans, is de toepassing van µ CT of MRI voor opeenvolgende observatie van bomen die in een gebied leven uiterst uitdagend omdat deze instrumenten niet draagbaar zijn. In tegenstelling, Cryo-SEM heeft een potentieel voor het gebruik van deze techniek op grote bomen in veldexperimenten om duidelijk te visualiseren waterinhoud op niet alleen het cellulaire niveau, maar ook op een fijnere structuur niveau, bijvoorbeeld, water in intervasculaire pits¹⁵, water in intercellulaire ruimten¹⁶, of bellen in waterkolom¹⁷.

Veel studies observeren Xylem water door Cryo-SEM zijn gemeld ^{5,12,18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) vestigde aanvankelijk het protocol voor observatie van Xylem in situ door bevriezen-bevestiging van een het leven boomstam via het vullen van LN₂ in een container die op de steel wordt geplaatst²¹. De temperatuur van de steekproef werd gehandhaafd onder-20 °C tijdens steekproef inzameling en tijdens Cryo-SEM voorbereiding om het smelten van het ijs binnen Xylem leidingen te vermijden. Deze methode is gebruikt om het water in Xylem te observeren om de waterverdeling te verduidelijken onder een ander waterregime^{11,12,24,25,26, 27,28}, de seizoensgebonden variatie van waterverdeling^21,29,30, het effect van Freeze-ontdooicycli^{17,31, 32}, de verdeling van water in nat hout⁵, veranderingen in de waterverdeling tijdens de overgang van spint naar heartwood²⁰, seizoengebonden tijdsverloop van cambial activiteit en differentiatie van schepen³³, en cavitatie geïnduceerd door bepaalde biotische beklemtoont^23,34. Hydraulische geleidbaarheid en leidingen kwetsbaarheid voor cavitatie zijn ook geverifieerd met behulp van Cryo-SEM^35,36. Cryo-SEM uitgerust met energie dispersieve röntgenstraal spectrometrie (EDX of EDS) is gebruikt om elementdistributie over de oppervlakte van een specimen te bestuderen dat water³⁷bevat.

Freeze-fixatie van een levende stam die leidingen bevat onder hoge hydraulische spanning veroorzaakt soms kunstmatige cavitatie die worden waargenomen door Cryo-SEM als gebroken ijs kristallen in het lumen van de leidingen^38,39. In het bijzonder, loof soorten met langere en bredere leidingen zijn kwetsbaar voor spanning-geïnduceerde artefacten, zoals cavitatie veroorzaakt doorsteek proef snijden, zelfs indien uitgevoerd onder water^3,40. De artefacten van de cavitatie worden opvallend na bemonstering van een het transpireren boom (d.w.z., bemonstering tijdens de dag tijd) of onder strenge droogte voorwaarden en zij kunnen aan een overschatting van cavitatie voorkomen misleiden^{3,38, 39}. Daarom moet de spanning die in de leidingen werkt worden vrijgegeven om de artefactuele cavitatie^3,12,39te vermijden.

De Freeze-fractuur techniek met behulp van een mes geïnstalleerd in een specimen kamer wordt vaak gebruikt om het monster oppervlak bloot voor Cryo-SEM observatie. Nochtans, zijn de bevriezen-gebroken vliegtuigen van bosrijke installatie weefsels, vooral transversale secties van secundaire Xylem, te ruw om de anatomische eigenschappen en het water in het weefsel⁶duidelijk waar te nemen. De toepassing van een cryostat voor het trimmen van een specimen maakt een snelle en kwalitatief hoogwaardige voorbereiding van monster oppervlakken^20,23mogelijk. Het algemene doel van deze methode is het verstrekken van bewijsmateriaal met elektronenmicroscopie resolutie van de waterverdeling in verschillende soorten Xylem cellen in situ zonder het voorkomen van bemonsterings artefacten. We introduceren onze geactualiseerde procedure, die gestaag is verbeterd sinds we voor het eerst aangenomen, met betrekking tot de bemonstering, trimmen en reinigen van het specimen oppervlak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige elektronen micrografen van Cryo-vaste monsters van Xylem.