공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

참고: 모든 단계 포함 라이브, 고정 되지 않은 셀의 사용 biosafety 후드에서 수행 해야 하 고 어떤 유해 폐기물 보건 및 안전 법규에 따라 폐기 해야 합니다. 1. 조 세포 Transfection 및 안정 조 셀 라인의 생성 조 셀 transfection참고: polyethylenimine (페이)를 사용 하 여 조 세포 transfection이이 섹션에 설명 합니다. 그러나, 다른 방법은 사용할 수 있습니다, 조 셀은 비교적 transfect 상용 지질 transfection 시 약을 사용 하 여 쉽게. 문화 조 세포 완전 한 F12 (cF12, 항생물질 진압의 식을 유지 하기와 5 S, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 10 µ g/mL blasticidin 보충 F12). 통로 셀 매 3-4 일 1:10 비율. Transfection, 전에 어느 날 조 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 세척 조 PBS T75 플라스 크, T25 플라스 크에 대 한 5 mL PBS에 대 한 pbs (10 mL)을 사용 하 여 플라스 크에 세포. 0.05% 추가 Trypsin/0.02% EDTA는 플라스 크에 PBS (T75 플라스 크, T25 플라스 크 1 l 2 l)에서 실 온 (RT)에서 5-10 분 동안 품 어 고. 가벼운 현미경을 사용 하 여, 확인 셀을 분리 했으면 trypsinization 플라스 크 (8 mL T75 플라스 크, T25 플라스 크에 대 한 4 mL에 대 한)에 cF12를 추가 하 여 중지 합니다. 15 mL 튜브, 및 4 ° C 또는 실시간 제거 상쾌한에 5 분 동안 300-400 x g 에서 원심 분리기 조 세포 현 탁 액을 전송 하 고 다시 cF12 T75 플라스 크, T25 플라스 크 5 mL (10 mL)에 일시 중단는 hemocytometer를 사용 하 여 계산. 60000-100000 조 셀/mL로 세포 농도 조정 합니다. 6 잘 플레이트에 잘 당 조 세포 현 탁 액 (300000-500, 000 조 셀)의 5 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어. Transfection는 하루에 1.5 mL 튜브에 혈 청 자유로운 F12 매체 또는 낮은 혈 청 미디어의 400 μ를 추가 합니다. 미디어의 400 μ에 플라스 미드의 3 μ g를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합. PEI의 6 μ g 추가 (1 mg/mL 페이 솔루션의 6 μ) 미디어/DNA 혼합, 및 10에 대 한 즉시와 동 s. 10-15 분 RT에서 미디어/DNA/페이 믹스를 품 어. 이 부 화 하는 동안 조 셀 미디어를 6 잘 플레이트에서 신선한 cF12 미디어의 5 mL 바꿉니다. 조 셀 미디어/DNA/페이 솔루션을 추가 합니다. 우물을 통해 고르게 dropwise 솔루션을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어. 안정적인 조 셀 라인의 세대 Transfection, 후에 1 일 우물에서 미디어를 제거 하 고 각 우물에 적절 한 선택 항생제를 포함 하는 cF12의 5 mL를 추가 합니다. PcDNA5TO 기반 플라스 미드 및 pcDNA3 기반 플라스 미드에 대 한 1 mg/mL geneticin 0.3 mg/mL hygromycin를 사용 합니다. 24 h에 90 %confluency 보다는 더 셀 범위 게시 transfection, 세포 trypsinize. 웰 스 잘 당 1 mL의 PBS로 세척, PBS에 0.05% trypsin/0.02% EDTA의 1 mL를 추가 하 고 가벼운 현미경 실시간 사용에 5-10 분 동안 품 어, 셀을 분리 했으면 잘 당 cF12의 3-4 mL를 추가 하 여 trypsinization 중지 확인. 15 mL 튜브, 및 4 ° C 또는 실시간 제거는 상쾌한에 5 분 동안 300-400 x g 에서 원심 분리기 조 세포 현 탁 액을 전송 하 고 다시 cF12의 10 mL에 일시 중단. 6 잘 플레이트에 잘 당 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. Transfected 세포의 수율을 최대화 하기 위해 두 개의 우물을 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 6 잘 플레이트를 품 어. 가벼운 현미경을 사용 하 여 저항 하는 식민지의 성장과 세포 죽음을 모니터링 합니다. 미디어를 제거 하 고 4-5 일 후, 또는 중요 한 세포 죽음은 관찰 하는 경우 적절 한 항생제를 포함 하는 신선한 미디어 바꿉니다. 일단 설명 대로 70% 합류 이상 저항 셀 범위 셀 trypsinize 1.2.2 단계에서 고 확장 T25 플라스 크를 전송. 항생제 선택 1-2 주 걸립니다. 항생제 내성 조 셀 T25 플라스 크에 합류 70-80%에 도달, 항 체 세포 표면 표현 관심의 구조를 확인 하려면 얼룩 수행 합니다. 1.2.2 단계에서 설명한 대로 항 체 얼룩이 지기 전에 1 일 셀 trypsinize 및 200, 000 셀/ml, 셀 농도 조정 하 고 12 잘 플레이트 세포 현 탁 액 1 mL를 추가. 항생물질을 유도할 수 있는 구조 테스트, 항생물질의 50-60 ng/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 우물의 바닥에서 조 세포를 분리. 이 메서드는 분해 분열 때문에 피토 프 손상의 위험을 줄일 수 trypsinization, 하는 것이 좋습니다. FACS 튜브를 조 셀을 포함 하는 미디어의 1 mL를 전송 합니다. 300-400 x g, 5 분 다시 중단 100 μ에 안티-HLA 항 체 FWB에 희석의 4 ° C에 아래로 회전 합니다. 얼음에 4 ° C에서 30 분을 품 어. 이 얼룩 총 A2 셀 표면 식 레벨, 감지 안티-A2 항 체와 TCR 같은 항 체 특정 a 2에 대 한 주 작동 근 pMHC 감지 하 E183 펩 티 드 복잡 한에서 수행-난 세포 표면 식 수준. 후 긍정적인 세포, MHC 식, FACS 종류를 확인 하 고 transgene 손실을 줄이기 위해 항생제를 가진 매체에서 정렬된 셀을 유지. 조 셀 주 작동 근 pMHC 표현, 단일 셀 정렬 것이 좋습니다, 비교 주 작동 근와 공동 주 작동 근 pMHC와 supertransfection 없이 pMHC 식 되도록. 2-3 주는 조 세포 성장 단일 셀 정렬 다음 필요 합니다. 2. HBV-특정 CTL 문화 HBV-특정 인간 CTL 다시 자극을 위해 모이 통으로 PBMCs의 준비참고: A2 E183 특정 CTL 클론에 대 한 해 동된 PBMCs, 보다는 오히려 갓 격리 된 PBMCs, 다시 자극 최상의 결과 제공.주의: 혈액 기부에 대 한 자원 봉사자를 모집 하기 전에 필요한 모든 윤리적인 승인의 얻을. 이 작품을 위해 PBMC 누스 IRB 승인 프로토콜 아래 건강 한 지원자에서 수집 되었다. 동의 모든 기증자 로부터 얻은 것입니다. 혈액 품 어진 질병의 전송의 위험을 줄이기 위해 인간의 피를 작업할 때 모든 필요한 예방 조치를 따르십시오. 시작 하기 전에, 19-20 ° C에서 원심 분리기 온도 설정 하 고 미리 실시간 밀도 그라데이션 (예: Ficoll) 따뜻한 50 mL 튜브에 방 온도 밀도 기울기의 15 mL를 추가 합니다. 19-20 ° c.에 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 이것은 아무 밀도 그라데이션 튜브 측에 확인 하입니다. Venipuncture 통해 건강 자원 봉사 기증자 로부터 20 mL의 혈액을 수집 합니다. 50 mL 튜브에 혈액의 20 ml PBS의 15 mL를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 천천히, 혈액 단계 2.1.2에서에서 밀도 기울기의 15 mL 위에 PBS에 희석의 35 mL를 추가 합니다. 혈액 및 밀도 그라데이션 혼합 하지 않습니다 다는 것을 확인 하십시오. 19 ° C, 브레이크 20 분 1200 x g 에서 튜브를 원심. 플라즈마 층의 약 70%를 제거 합니다. 조심 스럽게 발음 PBMC (분명 밀도 그라디언트 레이어 위에 흐린 레이어) 포함 된 레이어는 파스퇴르를 사용 하 여 플라스틱 및 새로운 50 mL 튜브에. 50 mL 전체 볼륨을 얻으려면 PBMCs를 PBS를 추가 합니다. 10 분은 신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기 및 멸 균 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 또는 decanting, 4 ° C, 300-400 x g 에서 튜브를 원심. 다시 50 ml PBS의 셀을 일시 중단 합니다. 10 분은 신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기 및 멸 균 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 또는 decanting, 4 ° C, 300 x g 에서 튜브를 원심. 다시 셀 완전 한 인간 T 세포 미디어 (혈 청 자유로운 미디어 2% 인간의 혈 청으로 보충)의 2 개 mL를 일시 중단 합니다. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 혈액의 1 mL 당 106 PBMCs x 1-2 평균 제공 합니다. CTL 다시 자극 피더 세포로 PBMCs를 사용 하 여 PBMCs 후속 자극에 대 한 응답에서 확산을 억제 하기 위해 30 Gy에서 비추는주의: 확인 하십시오 적절 한 교육 및 실험실 준수 안전 요구를 irradiator를 사용 하는 경우. 다시 2 x 106 셀/mL에서 완전 한 인간 T 세포 미디어에 비친된 PBMCs를 일시 중단 합니다. Cytokines와 lectin Phaseolus vulgaris (PHA)에서 PBMC 서 스 펜 션으로 2 배 농도에서 CTL 다시 자극에 대 한 추가 합니다. 마지막 cytokine와 PHA 농도: 20 U/mL 재조합 인간 일리노이-2, 10 ng/mL 재조합 일리노이-7, 10 ng/mL 재조합 인간 IL-15와 1.5 mg/mL PHA. 37 ° C 물 욕조에 냉동된 CTL 유리병 녹여 완전 한 인간 T 세포 미디어의 10 mL 15 mL 튜브에 해 동된 세포를 전송 합니다. 5 분은 신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기 및 멸 균 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 또는 decanting, 4 ° C에서 300-400 x g 에 아래로 회전 합니다. 다시 완전 한 인간 T 세포 미디어의 2 mL에 Ctl을 일시 중단 합니다. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 106 셀/mL의 세포 농도를 완전 한 인간 T 세포 미디어를 추가 합니다. 24 잘 접시에 추가 조사 PBMCs의 0.5 mL (106 셀) 2 x cytokines PHA (2.2.2 단계), 및 잘 당 Ctl (0.5 x 106 셀)의 0.5 mL. 사용 하는 우물의 수는 Ctl 또는 사용할 수 있는 PBMCs의 총 수에 따라 달라 집니다. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 후 4-5 일 때 CTL 폭발 되 고 미디어 된다 황색, 6 잘 플레이트에 문화를 전송 하 고 완전 한 인간 T 세포 미디어 20 U/mL 일리노이-2와 10 ng/mL 일리노이-7, 10 ng/mL IL-15 (PHA)의 4 mL와 함께 초기 1 mL 볼륨을 보충. 2-3 일 후 T75 플라스 크에 문화를 전송 하 고 완전 한 인간 T 세포 cytokines (단계 2.2.2, 아니 PHA) 미디어의 40 mL를 추가 하 고 수직 위치에서 문화. 유지 Ctl 1-2 x 106 셀/mL의 농도에서 cytokines (단계 2.2.2, 아니 PHA)으로 보충 하는 신선한 미디어를 추가 하 여 볼륨에서 기존 문화 볼륨의 동등한 매일에. Ctl 7-14 일 후에 다시 자극 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 3. T 세포 활성화 실험 참고: 전형적인 실험 필요로 여러 가지 다른 T-RExCHO 라인: untransfected T-렉스 조 세포 (부정적인 제어), T-렉스 조 세포 표현 비 물질로 pMHC만 (scA2-개 그, 부정적인 컨트롤), T-렉스 조 세포 표현 낮은 양의 주 작동 근 pMHC-나 ( scA2-항생물질, 실험 샘플 없이 환경을), T-렉스 조 세포 주 작동 근 pMHC의 낮은 금액와 높은 양의 비 물질로 공동 주 작동 근 pMHC (scA2 환경 및 scA2-개 그, 항생물질, 실험 샘플 없이), 및 T-렉스 조 세포 주 작동 근 pMHC의 높은 금액을 표현-나 항생물질, 긍정적인 통제와 scA2-환경을), 그림 1 cD와같이. 조 셀 항 원 제시 세포로 도금 T75 플라스 크, 1.1.1 단계에서 설명한 대로에 문화 조 셀. 70-90% 합류에 셀을 사용 하 여 최상의 결과 위해. T 세포 활성화 하기 전에 1 일 실험, 1.1.2 섹션에 설명 된 대로 셀을 trypsinize. Trypsinization, 후 세포 현 탁 액 15 mL 튜브, 4 ° C 또는 RT 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기로 전송, 상쾌한 pipetting 또는 decanting 제거. 다시 cF12의 5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 조 셀은 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. CF12를 사용 하 여 2 x 105/mL을 셀 농도 조정 합니다. 50-60 ng/mL는 주 작동 근에 항생물질의만 주 작동 근 pMHC의 높은 금액을 유도 하기 위해 샘플 추가-난 긍정적인 컨트롤 (그림 1C)로. 조 pipetting 또는 도금 하기 전에 vortexing 혼합 그래서 확인 셀 15 mL 튜브에 정착 됩니다. T 세포 활성화의 분석 결과 대 한 U-하단 96 잘 접시에 잘 당 조 세포 현 탁 액의 100 μ를 추가 하 고 조 셀 라인 당 triplicates를 사용 하 여. 조 셀 안티-MHC 얼룩, 12 잘 플레이트 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 고 셀 라인 당 triplicates를 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어. T 세포 활성화 분석 결과참고: 이 T 세포 활성화 분석 결과 T 세포 degranulation (CD107a 얼룩, 세포 독성 T 세포의 측정) 및 cytokine 생산의 동시 정량화를 허용 한다. 실험 전날 Ctl 셀 400 x g 5 분 동안 4 ° C에서 원심 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 다시 완전 한 인간 T 세포 미디어 cytokines 또는 PHA 없이 106 셀/mL에서 세포를 일시 중단. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 우리가이 단계 없이 항 원의 낮은 금액에 대 한 응답에서 최대 활성화를 관찰해 서이 나머지 단계의 목적은 CTL 감도 줄이는 것입니다. 400 x g 5 분, 4 ° c에서 원심 T 세포 실험 당일 decanting 또는 pipetting는 상쾌한을 제거 하 고 다시 2 mL (cytokines 또는 PHA) 없이 완전 한 혈 청 자유로운 미디어에 셀을 일시 중단 합니다. 라이브 T 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 106 라이브 셀/ml (cytokines 또는 PHA) 없이 완전 한 인간 T 세포 미디어를 사용 하 여 T 세포 농도 조정 합니다. 1: 100 희석 (2.5 μ g/mL의 최종 농도)에 반대로 인간 CD107a 항 체를 추가, brefeldin A 1:1000 희석 (1 μ g/mL의 최종 농도)에 추가 합니다. 유리 피 펫 파스퇴르 발음 하거나 접시를 터치 하 여 96 잘 접시의 조 세포에서 미디어를 제거 합니다. 잘, 당 200 μ T 세포 현 탁 액 (0.2 x 106 세포) 포함 하 안티-CD107a 및 brefeldin A. 공동 문화 T 세포의 3-4 h 조 셀을 추가 합니다. 공동 문화의 끝에, T 세포 표면 항 원 얼룩 수행 합니다. 96 잘 접시 300-400 x g, 4 ° C에서 5 분 아래로 회전 하 고 발음 또는 터치는 상쾌한을 제거 합니다. PBS (흐름 워시 버퍼, FWB)에 0.5 %BSA 세포 표면 항 원 얼룩 잘 당 50 μ에서 CD3의 2.5 μ와 CD8 항 체의 2.5 μ를 추가 합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 샘플을 품 어. 잘 당 FWB의 150 μ를 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 96 잘 접시 300-400 x g, 4 ° C에서 5 분 아래로 회전 하 고 발음 또는 터치는 상쾌한을 제거 합니다. 고정/permeabilization 키트를 사용 하 여 고정/permeabilization 단계를 수행 합니다. 잘 당 (고정/permeabilization kit)에서 고정/permeabilization 솔루션의 100 µ L를 추가, pipetting으로. 20 분 동안 얼음에 품 어. 300-400 x g 와 5 분, 4 ° C 원심 고 발음 또는 터치는 상쾌한을 제거 합니다. 파 마/워시 버퍼 x 1의 200 μ 추가 (10 파 마/워시 재고 버퍼 사용 하기 키트 전에 배 희석) 음 당. 이 단계를 반복 합니다. 다시 0.3 μ g/mL에서 안티-IFN-γ 항 체를 포함 하는 1 x 파 마/워시 버퍼의 50 μ에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음에 품 어. 1 x 파 마/워시 버퍼의 150 μ를 추가 합니다. 5 분 동안 4 ° C에 대 한 300-400 x g 에서 centrifuge 고 발음 또는 터치는 상쾌한을 제거 합니다. 파 마/워시 버퍼, x 1의 200 μ 300-400 x g 5 분, 4 ° C에서 원심 발음 또는 터치는 상쾌한 제거 추가 합니다. 다시 FWB의 200 μ에 각 샘플을 일시 중단 합니다. 흐름 cytometric 분석을 진행 합니다. 조 셀 MHC 종류 I 얼룩참고: scMHC를 확인 하는 것이 중요-난 세포 표면 수준 각 실험에 사용 하는 셀에 셀 라인 transgene 식을 잃을 수 있습니다. T 세포 자극에 대 한 96 잘 접시를 준비할 때 3.1.4 섹션에 설명 된 대로 12 잘 플레이트 조 셀, 얼룩이 지기에 대 한 설정. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 우물의 바닥에서 조 세포를 분리. 이 메서드는 분해 분열 때문에 피토 프 손상의 위험을 줄일 수 trypsinization, 하는 것이 좋습니다. FACS 튜브를 조 셀을 포함 하는 미디어의 1 mL를 전송 합니다. 300-400 x g 5 분 다시 중단 100 μ에 안티-HLA 항 체 FWB에 희석의 4 ° C에서에 아래로 회전 합니다. 얼음에 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 이 얼룩 총 A2 셀 표면 식 레벨, 감지 안티-A2 항 체와 TCR 같은 항 체 특정 a 2에 대 한 복잡 한 E183 펩 티 드32 주 작동 근 pMHC 감지 하 수행-난 세포 표면 식 수준. 각 조 샘플 하 FWB의 1 mL를 추가, 300-400 x g, 4 ° C, 5 분에서 아래로 회전 하 고 다시 FWB의 0.3 ml에서 샘플을 중단. 교류 cytometry 분석 진행.