Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento
Summary
A combinação de microscopia eletrônica de transmissão e transdução no útero é uma poderosa abordagem para o estudo de mudanças morfológicas na ultraestrutura fina do sistema nervoso durante o desenvolvimento. Este método combinado permite insights profundos sobre mudanças em detalhes estruturais subjacentes neuroplasticidade no que diz respeito a sua representação topográfica.
Abstract
O presente estudo combina transdução no útero com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) com o objetivo de uma análise morfométrica precisos dos parâmetros ultra-estruturais em inequivocamente identificadas estruturas topográficas, afetados por uma proteína de interesse que é introduzido no organismo através de transferência viral. Esta abordagem combinada permite uma transição suave de macrostructural para identificação ultraestrutural pelos seguintes mapas topográficos de navegação em um atlas de tecido. Microscopia eletrônica de alta resolução do tecido em-utero-transfectadas revela a ultraestrutura bem o neurópilo e seus parâmetros de plasticidade, como áreas seccionadas bouton sinápticos, o número de vesículas sinápticas e mitocôndrias dentro de um Perfil de Bouton, o comprimento de contatos sinápticos, áreas axonal seccionadas, a espessura das bainhas de mielina, o número de lamelas de mielina e seccionadas áreas de perfis de mitocôndrias. A análise destes parâmetros revela essenciais insights sobre alterações de plasticidade ultra-estruturais nas áreas do sistema nervoso que são afetados pela transferência viral da construção de genética. Este método combinado não só pode ser usado para estudar o efeito directo de biomoléculas geneticamente modificadas e/ou drogas na plasticidade neuronal, mas também abre a possibilidade de estudar o resgate no útero de plasticidade neuronal (por exemplo, no contexto da doenças neurodegenerativas).
Introduction
O fóton não pode penetrar uma amostra de tecido ultrafinos no grau de profundidade de um elétron. Isto atribui vantagens inestimáveis para TEM na captura de imagens de resolução nanômetros de belas estruturas quando comparado às técnicas de microscopia de luz. Por exemplo, TEM permite a visualização de organelas intracelulares, tais como mitocôndrias, melanossomas e vários tipos de grânulos secretórios, microtúbulos, microfilamentos, cílios, microvilli e junções intercelulares (superfície de célula especializações), em particular as sinapses no sistema nervoso1,2,3,4. O objetivo geral do presente estudo metodológico é o reconhecimento ultra-estrutural do mudanças na plasticidade neural durante o desenvolvimento, após interferência de pré-natal, combinando as técnicas do estado-da-arte de transdução no útero e TEM. Viralmente codificadas proteínas de interesse tem sido transfectadas no útero para o sistema nervoso central5,6,7, incluindo a medula espinhal6. Por exemplo, no útero transdução em combinação com a temperatura tem sido usada por estudando o efeito da molécula de adesão celular L1 na aprendizagem plasticidade em camundongos deficientes em L1, em particular no que se refere a interação entre L1 e proteínas do receptor nuclear de motor em neurônios Cerebelares7.
A análise dos parâmetros de neuroplasticidade requer informações precisas sobre a localização das áreas menores dentro do sistema nervoso. Portanto, é adequada descrever detalhes ultraestrutural e sua orientação topográfica exata em relação a outras estruturas. No presente estudo, é apresentado um método específico preparatório visando a investigação detalhada de áreas morfológicas distintas com base em luz e microscopia eletrônica. Esta abordagem combina várias técnicas de manipulação do tecido, começando no útero transdução da medula espinhal e cérebro de rato e seguido por fixação de perfusão, molde-incorporação e processamento de tecido para dez. Um passo essencial incluído entre a incorporação e a transformação do tecido para TEM é a documentação do tecido, usando a técnica de reflexão da luz de interferência que permite a documentação precisa de microphotographic e baixo-ampliação de espécimes do tecido8,9,10. Incorporada a presente abordagem, esta técnica permite que pesquisadores examinar detalhes topográficos e estruturais das superfícies de tecido nervoso e de perfis de fatia de amostra antes da sua preparação para a temperatura.
Um frame especial para secionar todo cérebro corresponde a coordenadas estereotáxicos. Este quadro beneficia morfológica reconstrução tridimensional (3D) de áreas no tecido nervoso e pode ser usado para Análise morfométrica. Os macrographs das seções visualizadas são atribuídos coordenadas topográficas e as seções numeradas em série construir mapas em um atlas de tecido.
Após processamento de resina, o tecido incorporado é seccionado em seções ultrathin (< 70 nm) que contém áreas selecionadas, de acordo com os mapas do atlas tecido acima mencionados. As seções ultra-finas estão sujeitos a temperatura para obter imagens de alta resolução dos parâmetros de plasticidade (e.g., seção transversal perfil áreas de boutons sinápticas ou fibras axonal) do seu conteúdo e de contatos para estruturas vizinhas, dentro do complexo neurópilo.
Com o método descrito neste documento, a transição suave de macrostructures visualizado para micro e nanoestruturas permite comparativos estudos aprofundados de plasticidade neuronal morfológica depois no utero transdução do desenvolvimento nervosa sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um passo crucial de transdução no útero é o procedimento de injeção. A injeção precisa em ventrículos cerebrais ou em outra área de interesse requer experiência e habilidade de hands-on. A mais fina a ponta de conta, o menor dano tecidual pode ocorrer; no entanto, isto é à custa do aumento da pressão de injeção. Em contraste com eletroporação no útero19,20,21,22, a taxa de so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores Agradecemos aos colegas do centro de animais na faculdade de medicina, Universidade de Ruhr Bochum, seus cuidados de suporte e animal.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
