הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה
Summary
השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.
Abstract
המחקר הנוכחי משלב התמרה חושית ברחם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מכוון ניתוח morphometrical מדויק של פרמטרים ultrastructural במבנים הטופוגרפי חד משמעית מזוהה, מושפע חלבון עניין זה הוא הציג לתוך האורגניזם באמצעות העברה ויראלי. גישה משולבת זו מאפשר מעבר חלק מ macrostructural כדי ultrastructural זיהוי על ידי מפות ניווט הטופוגרפי הבאים באטלס רקמות. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של הרקמה בעם רחם-transduced חושף את ultrastructure בסדר של מורכב ואת הפרמטרים שלה פלסטיות, כגון אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספר הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים, אזורים עצב בחתך רוחב, העובי של עטיפות המיאלין, המספר של מיאלין lamellae ואזורי בחתך רוחב של המיטוכונדריה פרופילים. הניתוח של פרמטרים אלה מגלה חיוני תובנות שינויים של ultrastructural פלסטיות באזורים של מערכת העצבים המושפעות על-ידי העברת ויראלי הבונה גנטי. שיטה משולבת זו לא ניתן להשתמש רק ללמוד על השפעה ישירה של מולקולות מהונדס גנטית ו/או סמים על פלסטיות עצביים אבל פותח גם את האפשרות ללמוד חילוץ ברחם פלסטיות עצביים (למשל, בהקשר של מחלות ניווניות).
Introduction
פוטון לא יכולים לחדור של דגימות רקמה ודק במיוחד בכיתה עומק של אלקטרון. זה מייחסת יתרונות שלא יסולא בפז TEM בלכידת ננומטר תמונות ברזולוציה של המבנים המרשימים לעומת טכניקות במיקרוסקופ אור. לדוגמה, TEM מאפשר החזיית תאיים organelles כגון המיטוכונדריה, melanosomes, סוגים שונים של הפרשה בגרגרים, microtubules, שמתרגם, cilia, microvilli, והצמתים המערכת (תא השטח מתמחה), בפרט synapses מערכת העצבים1,2,3,4. המטרה הכוללת של מתודולוגי במחקר הוא ההכרה ultrastructural של שינויים פלסטיות עצבית במהלך הפיתוח על הפרעה לפני הלידה על-ידי שילוב טכניקות המדינה-of-the-art של התמרה חושית ברחם, TEM. לשווק מקודד חלבונים עניין יש כבר transduced ברחם לתוך מערכת העצבים המרכזית5,6,7, כולל את חוט השדרה6. למשל, נעשה שימוש ברחם התמרה חושית בשילוב עם TEM לימוד ההשפעה של המולקולה אדהזיה תא L1 על למידה פלסטיות בעכברים חשוכת-L1, בפרט לגבי יחסי הגומלין בין L1 חלבונים גרעיניים קולטן מוטורית בנוירונים אסטרוציטומה7.
הניתוח של פרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית דורש מידע מדויק על הלוקליזציה של האזורים הקטנים בתוך מערכת העצבים. לכן, זה מספיק כדי לתאר פרטים ultrastructural ונטיותיהם הטופוגרפי המדויק לגבי מבנים אחרים. במחקר הנוכחי, מוצגת שיטת הכנה ספציפיים מכוון החקירה נתונים היסטוריים של תחומים ברורים מורפולוגי המבוסס על אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו משלבת מספר טכניקות של רקמות מניפולציה, החל ברחם התמרה חושית של העכבר המוח ואת חוט השדרה ואחריו יציבות זלוף, הטבעה-עובש, עיבוד הרקמה TEM. צעד חיוני כללה בין את ההטמעה, העיבוד של הרקמה עבור TEM הוא התיעוד של הרקמה, בטכניקה הפרעות השתקפות אור המאפשר מדויק microphotographic והגדלה נמוכה תיעוד רקמות דגימות8,9,10. טכניקה זו שולבו הגישה הנוכחית, מאפשר לחוקרים לבחון פרטים הטופוגרפי ומבניים של רקמות עצבים משטחים ושל הדגימה פרופילים פרוסה לפני שלהם לקראת TEM.
מסגרת מיוחדת עבור חלוקתה המוח כולו מתאים קואורדינטות stereotaxic. מסגרת זו מועילה מורפולוגי תלת מימדי (3D) בבניה מחדש של אזורי ברקמות עצבים, והוא יכול לשמש לניתוח morphometric. Macrographs הסעיפים מטמיעים מוקצים קואורדינטות הטופוגרפי, ולבנות הסעיפים ממוספרים באופן סדרתי מפות אטלס רקמות.
לאחר שרף עיבוד, הרקמה מוטבע הוא למחלקה למקטעים זגוגית (< 70 ננומטר) המכילים אזורים נבחרים, לפי המפות של הרי האטלס הרקמות הנ ל. הסעיפים זגוגית ותוחלת TEM להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פלסטיות פרמטרים (למשל, חתך פרופיל תחומי עם העיתון ons סינפטית או סיבי עצב) של התוכן שלהם ושל אנשי קשר למבנים הסמוכים בתוך המתחם מורכב.
בשיטת המתוארים בזאת, חלקה המעבר macrostructures מטמיעים מיקרו – ו nanostructures היתרי השוואתי מעמיק של פלסטיות מורפולוגית עצביים לאחר בתוך הרחם התמרה חושית לפתח לחוצה מערכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעד מכריע של התמרה חושית ברחם הוא ההליך הזרקה. הזרקה מדויקת לתוך המוח החדרים או תחום התעניינות נוסף דורש ניסיון ומיומנות מעשית. רזה הטיפ microcapillary, הנזק רקמות עלולות להתרחש; עם זאת, זה על חשבון הגדלת הזרקה בלחץ. בניגוד אלקטרופורציה ברחם19,20,21<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה העמיתים של המתקן בעלי חיים בפקולטה לרפואה, אוניברסיטת הרוהר בוכום, תמיכה וטיפול החיה שלהם.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
