تجميع المكوكات الجزيئية مدعوم بشكل قابل للعكس يعلق كينيسينس
Summary
نقدم بروتوكول لبناء المكوكات الجزيئية، حيث دفع البروتينات موتور kinesin التقيد سطح الصبغ المسمى microtubules. التفاعلات الضعيفة من كينيسينس مع السطح تمكن تمسكهم عكسها له. وهذا يخلق نظام النانو الذي يسلك الجمعية دينامية، وتفكيك عناصره، مع احتفاظها بوظيفتها.
Abstract
هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء مدعوم kinesin المكوكات الجزيئية مع مرفق ضعيفة وعكسها كينيسينس على السطح. على النقيض من البروتوكولات السابقة، في هذا النظام، microtubules توظيف البروتينات kinesin موتور من الحل ووضعها على سطح. بدوره، سيسهل كينيسينس التزلق ميكروتوبوليس على طول السطح قبل المعزولة إلى حل الجزء الأكبر، وهكذا يجري المتاحة لتوظيف مرة أخرى. هذه الجمعية المستمر والتفكيك يؤدي إلى ضرب السلوك الديناميكي في النظام، مثل تشكيل مسارات kinesin مؤقتة مزلق microtubules.
سيتم وصف عدة طرق تجريبية في جميع أنحاء هذه التجربة: ستستخدم كانت الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لتحديد تركيز الحلول المخزون من المواد الكاشفة، كوفيرسليبس ستكون أولاً الأوزون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معاملة ومن ثم سيلانيزيد قبل يجري تركيبة في تدفق الخلايا، والأسفار التأمل الداخلي الإجمالي ستستخدم مجهرية (TIRF) للصورة في نفس الوقت kinesin موتورز وخيوط ميكروتوبولي.
Introduction
التفاعلات تنظم سلوك نانوسيستيمس نشطة اتسمت دائماً بسندات طويلة الأمد، ولا رجعة فيه نحو1،2،3،،من45،6 ،،من78. مثال مدروسة لهذا هو نظام microtubule kinesin، حيث دفعت microtubules التزلق kinesin سطح زمنياً لا رجعة فيه للسيارات1،2،3،4، 5. النظم التي ترتبط المكونات عكسية لأحد آخر قد تم دراستها نظرياً9،10 وحققت في11،ماكروسكالي12، ولكن القياس هذه النظم وصولاً إلى وقد النانوي تحديا. واحد من الأسباب الرئيسية لذلك هو أن كسر وإصلاح الروابط بين المكونات غالباً ما يتطلب إجراء تغيير كبير في الظروف البيئية. على الرغم من أن هذه التغييرات قد نفذت في الماضي14،،من1315، أنها سوف تعتمد على تعديل النظام نفسه بدلاً من أن يتكيف مع بيئته. تصميم أنظمة الحجم الجزيئي فيها المكونات باستمرار تجميع وإعادة تنظيم الهياكل دون الإخلال بالبيئة العامة التي تجري فيها التجارب سوف تفتح الباب لاستكشاف مجموعة واسعة من السلوكيات الحيوية 16 , 17.
وهنا، يمكننا وصف وإثبات البروتوكول مفصلاً لإنشاء شكل حيوي تجميع وتفكيك نظام يعمل على النانو. وكان النظام وسلوكه العام سابق أدخل18: خيوط microtubule هي تدفعها إلى مسارات عكسية سطح زمنياً kinesin-1 المحركات. هذه البروتينات موتور kinesin يعينون من الحل للمساعدة في دفع ميكروتوبوليس إلى الأمام، قبل المعزولة بعد ذلك مرة أخرى بعد قليل. مرة واحدة مرة أخرى في الحل، يمكن أن يكون تعيينهم مرة أخرى لدفع من ميكروتوبولي جديدة. في13،الماضية14،15وكسر وإصلاح للسندات المطلوبة التعديلات البيئية؛ وفي المقابل، البيئة لدينا خلية تدفق يتغير بينما المحركات kinesin تتفاعل مع السطح.
وسيساعد هذا البروتوكول الباحثين المهتمين (1) تصور جميع الخطوات للبروتوكول، و (2) المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذا النوع من التحليل. أنها استمدت من الإجراءات الوارد وصفها في هوارد et al. 199319.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، نحن نقدم نظام النانو نشطة التي ذاتية تجمع ضعيف ملزمة اللبنات الأساسية لبناء المسار الخاص به. كما هو مبين في الشكل 1، microtubules التزلق تتراكم kinesin موتورز من الحل وإيداعها على السطح. تبقى المحركات kinesin في أعقاب microtubule فترة قصيرة من الزمن قبل العودة إلى الحل. وهكذا، في هذه التجربة، kinesin موتورز بديلة بين 3 دول:
(1) دولة واحدة زمنياً ميكروتوبولي: هذا عندما تربط kinesin أولاً ميكروتوبولي. فإنه يوجد في حالة توازن مع الدولة (2).
(2) دولة مزدوجة زمنياً: وفي هذه الحالة، kinesin واحدة زمنياً microtubule أيضا بربط السطح عبر به صاحب العلامة. يسمح هذه الدولة مزدوجة زمنياً للدفع ميكروتوبولي.
(3) دولة زمنياً على سطح واحد: kinesin مزدوجة زمنياً قد خرج من نهاية ميكروتوبولي، وقد لا ديسوربيد حتى الآن من على سطح الأرض في هذه الحالة. ويمكن ملاحظة هذه المحركات في الشكل 1 (قنوات مجتمعة والخضراء): أنها تمتد خلف ذيل microtubule لعدة ميكرومتر وتشكل على درب تقليص.
أن الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو تشكيل السطح مسعور على الشريحة. أنها تستخدم المواد الكيميائية الخطرة، بل أنها تسمح أيضا شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع فريق الإدارة الوطنية للسياحة على معطف السطح، ثم يسمح kinesin لربط عكسية إلى السطح. خطوة هامة أخرى هي ختم الخلية تدفق مع الشحوم. وهذا يسمح للتصوير المطول بدون السائل في التبخر خلية تدفق.
التعديلات الرئيسية لهذه التقنية تتكون من تغيير تركيز ميكروتوبولي وتركيز kinesin وتركيز ATP. تغيير تركيز microtubule سيغير عدد microtubules الانزلاق على السطح. تغيير تركيز kinesin سيغير عدد جزيئات kinesin الذي يمكن ربطه ميكروتوبولي. ومع ذلك، يمكن زيادة زيادة تركيز kinesin أعلاه المبالغ التي سبق تعريفها في هذه التجربة fluorescence الخلفية، مما يجعل من الصعب أكثر راجع مسارات kinesin خلفها مزلق microtubules. وفي الوقت نفسه، خفض تركيزات ATP أدناه 10 ميكرون ستنخفض إلى حد كبير microtubule مزلق السرعة. إذا كان المطلوب هو هذا التأثير، من الضروري استخدام ATP تجديد نظام يتكون من الفوسفاتيز الكرياتين وفوسفوكيناسي.
حد ممكن من هذا الأسلوب هو أنه، بسبب محتوى kinesin نشاطا كبيرا للنظام، يمكن أن تستهلك ATP سرعة، والتجارب قد تستغرق أقل من ساعة في ظروف معينة. وهذا على سبيل المثال سيكون عليه الحال إذا أحد تستخدم ذات شقين kinesin أعلى تركيز وخمسة إضعاف تركيز microtubule أعلى من ما تم عرضه في هذا البروتوكول.
لدينا عمل السابقة18، درسنا التوزيع المكاني للمحركات kinesin على طول microtubules، تثبت أن تتراكم microtubules التزلق موتورز kinesin من الحل، أدى إلى زيادة في كثافة السيارات على الطول microtubule. كما وجدنا أن تثبت التزلق الاستقرار microtubules من اعتماد غير خطية على سرعة التركيز و microtubule kinesin الحل.
عرض البروتوكول يمهد الطريق لاستخدام أكثر كفاءة للبروتين للسيارات في نظم النانومترية الحجم هندسيا لإجراء مزيد من التحقيقات في التصميم نانوسيستيمس النشطة الموجودة في توازن دينامي. وعلاوة على ذلك، الطابع الدينامي لهذا النظام يسمح لها بالعمل كنظام نموذجي لدراسة استبدال المكونات الجزيئية، سد جزء من الفجوة بين الهياكل الطبيعية وهندستها الشفاء الذاتي ودينامية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي في إطار جبهة الخلاص الوطني منحة 1807514 جبهة الخلاص الوطني-هيئة الهجرة واللاجئين. يشكر المؤلفون غ. باتشاند وفانديليندير ف لتوفير البروتين kinesin التجارة والنقل. هذا العمل قد أنجز، في جزء منه، في مركز “تكنولوجيات النانو المتكاملة”، وتشغيل “مرفق المستخدم التابع” لمكتب العلوم “مكتب العلوم لنا الطاقة” (وزارة) من “مختبر لوس ألاموس الوطني” (العقد لا. DE-AC52-06NA25396) و “سانديا الوطنية” (يخدع المسالك رقم 97 دي-AC04-94AL85000). يشكر المؤلفون الدكتورة جنيفر نيف والأوعية الدموية اللفيفو للهدية من شماعة-PPG-شماعة فونكتيوناليزيد مع الإدارة الوطنية للسياحة.
Materials
| 488 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 488-150 | |
| 642 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 642 | |
| Casein | Sigma | C7078-500G | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40-500MG | |
| Creatine Phosphate | Sigma | P-7936 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma | C3755-500UN | |
| D-Glucose | Sigma | G2133-50KU | |
| Dichlorodimethylsilane solution | Sigma | 40140-25ML | Toxic |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | 34869-100ML | |
| Dithiothreitol | Sigma | D0632-5G | Toxic |
| Eclipse TI | Nikon Instruments | ||
| eGFP rkin430 | Provided by George Bachand | ||
| EGTA | Sigma | E4378-25G | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose Oxidase | Sigma | G0543-10KU | |
| Guanosine Triphosphate | Sigma | G8877-10MG | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Sigma Pharmaceuticals | 8089 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M1028-100ML | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412 | Toxic |
| Milli-Q Water Purification System | Millipore Corporation | ||
| Nickel Sulfate | Sigma | 656895-50G | |
| Paclitaxel | Sigma | T1912-5MG | |
| PIPES | Sigma | P-6757 | |
| Pluronic F108-NTA | Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular | PEG-PPG-PEG-NTA | |
| Pluronic F-108 | Sigma | 542342-250G | PEG-PPG-PEG |
| Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 21-403-190 | |
| Toluene | Fisher Chemical | T324 | Toxic |
| Tubulin, HiLyte647-labeled | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | |
| UV Ozone Procleaner | BioForce Nanosciences | PC440 | |
| Whatman Puradisc syringe filters | Sigma | WHA67840402 | |
| Zyla 4.2 sCMOS Camera | Andor Technology | sCMOS 4.2 |
References
- Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
- Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule’s Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
- Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
- Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603 (2010).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
- Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
- Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
- Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
- England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).
- Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
- Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
- Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
- Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
- Ghosh, S. K., Ghosh, S. K. . Self-Healing Materials. , 1-28 (2009).
- Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
- Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature’s Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
- Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
- Lam, A. T. -. C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
- Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L., Yada, R. Y. . Proteins in Food Processing (Second Edition). , 49-92 (2018).
- Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).
