Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

В конечном счете биологическая деятельность осуществляется белков, Последнее из которых взаимодействовать с другими для надлежащего биологических функций. Используя вычислительный подход, общее количество белок белковых взаимодействий в человека оценивается в¹~ 650 000, и нарушения этих взаимодействий часто приводит к заболеваниям². Из-за их существенно важную роль в контроле процессов клеточной и научные многочисленные методы были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, такие как дрожжи 2 гибрида, bimolecular флуоресценции комплементарности, Сплит Люцифераза дополнения и co иммунопреципитация пробирного³. Хотя эти методы являются хорошими на открытие и подтверждение белок белковых взаимодействий, они обычно неколичественного и таким образом предоставляют ограниченную информацию о сходство между взаимодействия партнеров белка. Количественные тянуть Даунс может использоваться для измерения сродство (например, Константа диссоциации K_d), но он не измерить кинетика привязки не могут быть применены, когда K_d очень низка из-за неадекватной Соотношение сигнал шум⁴. Спектроскопия резонанса (СРП) поверхностного плазмон количественно кинетики привязки, но она требует удельной поверхности и иммобилизация одной реагент на поверхности, которые потенциально могут изменить свойство привязки реагент⁵. Кроме того это трудно для СРП для измерения быстро ассоциации и диссоциации ставки⁵, и это не целесообразно использовать СРП для характеризуют событие обмена субблоков протеина в комплекс белков. Здесь мы описываем метод, который позволяет измерения количества белка сложные сборки и разборки в масштабе времени миллисекунду. Этот метод имеет важное значение для определения роли Cullin –ssociated –Nedd8 –дissociated белок 1 (Cand1) как F-box белка обмен фактор^6,7.

Cand1 регулирует динамика Skp1•Cul1•F-бокс белка (SCF) E3 ligases, которые принадлежат к большой семье Каллин-кольцо убиквитин ligases. Заявок состоят из Каллин Cul1, который связывает кольцо домен белка Rbx1, и взаимозаменяемыми F-box белка, который вербует субстратов и связывает Cul1 через адаптер белок СКП1⁸. Лигаза E3 SCF катализирует спряжение убиквитин к его основанию, а он активируется, когда субстрат завербован F-box белка, и когда Cul1 изменяется убиквитин подобных белков Nedd8⁹. Cand1 связывает неизмененном Cul1, и после привязки, она разрушает как ассоциации белка Skp1•F-бокс с Cul1 и спряжение Nedd8 Cul1^10,11,12,13. В результате Cand1, по-видимому, ингибитор SCF активности в пробирке, но Cand1 дефицита в организмах причиной дефектов, которые предполагает позитивную роль Cand1 в регулировании деятельности компаний СКФ в vivo^{14,,1516 , 17}. Этот парадокс объясняется наконец количественного исследования, которые показали динамического взаимодействия между Cul1, Cand1 и Skp1•F-бокс белка. С помощью флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА) анализов, которые обнаруживают формирования СКФ и Cul1•Cand1 комплексов, ассоциации и диссоциации оценить константы (k_на и k_от, соответственно) были измеряется в отдельности. Измерения показали, что Cand1 и Skp1•F-бокс белка форме крайне сжатые комплекс с Cul1, но k_от SCF резко увеличивается на Cand1 и k_от Cul1•Cand1 резко увеличилось Skp1•F-бокс белок^6,7. Эти результаты обеспечивают поддержку первоначальных и критических для определения роли Cand1 как фактор обмена белков, который катализирует образование комплексов новых SCF путем переработки Cul1 от старых СКФ комплексами.

Здесь мы представляем процедура разработки и использования ладу assay для изучения динамики Cul1•Cand1 комплекс⁷, и тот же принцип может применяться для изучения динамики различных биомолекул. ЛАДУ происходит, когда донор возбужденных с соответствующей длины волны, и акцептора с перекрывающихся доноров спектр излучения спектра возбуждения присутствует на расстоянии 10-100 Å. Возбужденное состояние передается акцептор, тем самым уменьшается интенсивность доноров и увеличения интенсивности акцептора¹⁸. Эффективность ладу (E) зависит от радиуса Фёрстер (R₀) и расстояние между доноров и акцепторов флуорофоров (r) и определяется: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). Радиус Фёрстер (R₀) зависит от нескольких факторов, включая угловые ориентацию диполя, спектральные совпадения донорно акцепторной пара и решение используется¹⁹. Применять assay ладу на остановился потока fluorimeter, который отслеживает изменения выбросов доноров в режиме реального времени и обеспечивает измерение быстро k_на и k_от, необходимо создать эффективный ладу, приводит к значительному сокращению выбросов доноров. Таким образом проектирование эффективных ладу, выбрав соответствующие пары флуоресцентных красителей и сайтов на целевых белков прикрепить красители имеет важное значение и будут обсуждаться в настоящем Протоколе.