生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

ソリューション 組成 細胞培養とトランスフェクション DMEM1 DMEM 1 x 1 s (v/v) 1% (v/v) GlutaMAX DMEM10 DMEM 1 x 10 s (v/v) 1% (v/v) GlutaMAX 150 mM の NaCl 4.380 g 塩化ナトリウム 500 mL の超純水まで AAV の精製と脱塩 5 M の NaCl 146.1 g 塩化ナトリウム 500 mL の超純水まで 1 M トリス塩酸 (pH 8.5) 12.11 g トリス基地 注意 100 mL の超純水まで 8.5 に pH を減らすためにパスツール ピペットを使用して 1 M 塩酸を追加します。 換散バッファー 5 M の NaCl の 15 mL 1 M トリス塩酸 (Ph8.5) 25 mL 注意 500 mL の超純水まで リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 10 塩化ナトリウム 80 g 2 g KCl 注意 14.4 g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4 Dd水 1 L まで 1 M MgCl2 20.33 g MgCl2-6 H2O 100 mL の超純水まで 1 M KCl 7.45 g KCl 注意 100 mL の超純水まで マグネシウム カリウム PBS (PBS MK) 原液 x 5 10 x PBS の 250 mL 1 M MgCl2の 2.5 mL 1 M の KCl の 6.25 mL 注意 500 mL の超純水水 H2O 15 %iodixanol Optiprep 密度勾配媒体の 12.5 mL 注意 5 M の NaCl を 10 mL 5 の 10 mL PBS MK x 超純水の 17.5 mL 25 %iodixanol Optiprep 密度勾配媒体の 20.8 mL 注意 5 の 10 mL PBS MK x 19.2 mL の超純水水 フェノールレッドの 100 μ L 40 %iodixanol Optiprep 密度勾配媒体の 33.3 mL 注意 5 の 10 mL PBS MK x 超純水の 6.7 mL 60 %iodixanol Optiprep 密度勾配媒体の 50 mL 注意 フェノールレッドの 100 μ L 注意 AAV 純度制御 トリス酢酸 EDTA (茶) バッファー x 10 44.8 g トリス基地 注意 11.4 mL の氷酢酸 (17.4M) 3.7 g EDTA 1 L の純水まで Agarose のゲル 超高純度のアガロースを 0.8 g 最大 100 mL 1 x 茶バッファー ゲルのバッファー 181.7 g トリス基地 注意 1.5 g SDS 注意 8.45 1 M 塩酸で pH を調整します。 注意 500 mL の超純水まで 陰極バッファー 10x 121.14 g トリス基地 注意 179.2 g トリシン 注意 1 %sds (w/w) 注意 1 L の純水まで 陽極バッファー 10x 242.3 g トリス基地 注意 1 L の純水まで 8.9 1 M 塩酸で pH を調整します。 注意 サンプル バッファー 5 x 20 ml: 605 mg トリス基地 注意 4 g SDS 注意 10 mg に Serva ブルー G 12 g グリセロール 6.8 1 M HCl、分注で pH を調整し、-20 ° C で保存 注意 スタッキングのゲル 2 ゲル。 400 μ L アクリルアミド 注意 750 μ L のゲルのバッファー 1.85 mL 純水 4 Μ L TEMED 注意 20 μ L の 10 %ap (v/v) 注意 TEMED と 10% 追加すぐにゲルを注入する前に AP。化学のフードの下で両方の化学物質を使用します。 解決のゲル 2 ゲル。 3.32 mL アクリルアミド 注意 3.35 mL ゲル バッファー 1.14 mL 純水 2.12 mL 50% グリセロール 6 Μ L TEMED 注意 50 μ L の 10% (w/v) APS 注意 TEMED と 10% 追加すぐにゲルを注入する前に AP。化学のフードの下で両方の化学物質を使用します。 水飽和ブタノール n-ブタノール 10 mL 注意 1 mL の超純水 注意:危険な化学物質の使用に関するガイドラインについては表を参照してください。 表 1: 必要なソリューションの成分。 1. トライ – HEK293T 細胞のトランスフェクション 注:バッファーおよび解決プロトコルで使用の構成のための表 1を参照してください。注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 4 日間かかります。 37 ° C で設定水浴の人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞のバイアルを解凍します。注:20 x では未満継代されているセルのみを使用して、最適なトランスフェクション効率を保証します。 2 x 103 6 x 103セル/cm2 DMEM10 で直径 15 cm の密度でシード HEK293T 細胞は細胞培養皿です。 70-80% 95% 湿度と 5% CO2の 37 ° C で設定標準のインキュベーターで合流するセルを育てなさい。注:このプロトコルを使用しての AAV のベクトルの 1 つのバッチの生産 18 細胞培養皿 (直径 15 cm) が必要です。セルの合流点の 70%-80% は 6 × 103 7 x 103セル/cm2DMEM10 培地の 17-20 mL で維持するに対応します。 ポリエチレンイミン (PEI) を準備/1/3.5 (w/w) の濃度比で DNA がミックスします。 PΔF6、pCapsid、180 μ g、150 mM の NaCl の 18 mL で pTransgene の 180 μ g の 360 μ g を混合することによって 1 つの 50 mL の円錐管に 18 の細胞培養皿の DNA ミックスを準備します。 (DNA の 6 mL の円錐管あたりミックス) 3 つの 50 mL の円錐管に DNA ミックスを分散します。 PEI の 840 μ g を混合することによって新しい 50 mL の円錐管に培養皿の携帯 6 用ペイ ミックスを準備 (1 μ g/μ L) 150 mM の NaCl の 6 mL の。 一滴ずつ (1.4.3 の手順で準備) ペイ ミックスの 6 mL を追加してペイ/DNA ミックスを準備、(1.4.2 の手順で準備) DNA のミックスを含む円錐管の 1 つに、室温で 20 分間インキュベートします。注:インキュベーションの 20 分後、ペイ/DNA ミックスはわずかに濁ったになります。 インキュベーター外 6 細胞培養皿を取るし、完全に層流フードの各培養皿から培地を吸引します。Prewarmed ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 5 mL で皿を洗浄によって媒体の痕跡を削除します。 軽く皿を傾けることによって確実に表面全体に DPBS 配布。 優しく、DPBS を吸引、DMEM1 の 12 mL をそれぞれの料理に追加します。注:皿の端に置かれたピペットからゆっくりと、メディアを追加することによって、細胞をデタッチしないでください。 3 倍 – 5 倍上下ピペッティングでペイ/DNA をミックスします。慎重に表面全体に分散滴ずつファッションで 6 細胞培養皿のそれぞれにペイ/DNA ミックス 2 mL を追加します。それぞれの皿にミックスを追加すると、一度は、インキュベーターに料理を配置します。手順 1.4.3– を繰り返して残りの培養皿の 1.8。 37 ° C、湿度 95% と 5% で 5 時間 transfected セルを孵化させなさい CO2. 既存メディアを削除せず各培養皿に 12 mL の追加 DMEM10 を追加 (中容量 25 mL を =)。 95% 湿度と 5% CO2の 37 ° C で 72 時間後トランスフェクションするを transfected セルを孵化させなさい。 補足図 1: HEK 293 t 細胞の形態 (右) 蛍光で可視化した GFP 発現の確認と位相差顕微鏡 (左) で可視化した。(A) 成功したトランスフェクション GFP エンコーディング pTransgene HEK293T 細胞の蛍光イメージングにより確認しています。(B) HEK293T 細胞トランスフェクション試薬とのみは GFP 発現を示さない。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 培地、細胞 72 h 後トランスフェクションを収穫します。慎重に培養皿からセルをデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。媒体および氷で保たれる 50 mL のコニカル チューブに細胞を収集します。注:2 つの細胞培養皿の内容は、単一の 50 mL の円錐管に収集できます。この手順の最後に、9 つのチューブの各媒体の約 50 mL が含まれます。 420 x gの加速度と減速度を最大に設定する遠心分離機の 4 ° C で 10 分間で円錐管を遠心します。 慎重に各チューブから上澄みを廃棄します。材料の損失を防ぐためには、ピペットを使用しないでください。代わりに、そっと廃棄物処理容器に上清を注ぎ、氷の上に戻って細胞ペレットを含むチューブを置きます。 5-10 x 上下ピペッティングで 2 mL の 50 mL の円錐管に直接換散バッファーの各細胞ペレットを再懸濁します。ボルテックスにかけないでください。一緒に 3 つの管から溶解液をプールします。注:この時点で 3 つ 50 mL コニカル チューブ、再懸濁細胞の換散バッファーの各 1 つ含む 6 mL があります。 2. AAV ベクター精製 注:このプロトコル セクションのパフォーマンスは、約 1 日かかります。換散バッファーで再停止されるセルを含む 3 つの 50 mL の円錐管のそれぞれに同時に次の手順に従います (上述のメモを参照してください)。 凍結し、解凍再懸濁細胞 3 x それらし、AAV 粒子を解放します。ドライアイスとエタノール混合を含むバケツにチューブを配置することによって凍結の手順を実行します。すぐに 37 ° C で設定水浴のセルを配置することによって解凍実行します。 3 番目の解凍手順後 4 ° C で 15 分間 1,167 × gで遠心分離機注:細胞の残骸で構成される顕著なペレットに形成されます。チューブを処理する場合は、これらは最終的なベクトルの純度を妥協培養上清にペレットの剥離を引き起こす可能性がある急な動きを避けてください。 50 mL の円錐管をきれいに清を慎重に転送し、50 U/mL の培養上清中の最終的な集中に、各チューブにヌクレアーゼを追加します。 37 ° C で 30 分間インキュベートします。旋回 50 mL の円錐管手で 10 分毎、ヌクレアーゼは上清に徹底的に混ぜ、ように。 4 ° C で 20 分間 13,490 × gで遠心分離して上澄みを明らかにします。 10 mL のシリンジに 0.45 μ m フィルターを付けるし、きれいな 50 mL の円錐管の上に配置。慎重にプランジャーを取り外します、ステップ 2.5 から上清と注射器を埋めます。 フィルターを通してライセートを強制的にプランジャーを使用します。手順 2.5 で得られた上清の各チューブの新しいフィルターと注射器を使用します。注:得られた画分は、’原油ライセート’ と呼ばれます。 表 1の指示に従って各 4 つの別の 50 mL の円錐管で 15%、25%、40%、60 %iodixanol の分数を準備します。 Iodixanol の分数の次の順序を使用して 3 つの遠心管の iodixanol の勾配の準備: 60 %iodixanol の 4.5 mL、5 mL 40 %iodixanol の 5.5 mL 25 %iodixanol の 15 %iodixanol の 8 mL。注意:Iodixanol は、目、皮膚、消化管や呼吸器管に炎症を引き起こすことができます。Iodixanol の勾配を処理する場合は、手袋を着用し、層流フードの下で動作します。 各遠心チューブに 15 %iodixanol の 8 mL のピペットします。 きれいな 50 mL の円錐管 (図 1 a) に 25 %iodixanol 溶液 5.5 mL のピペットします。 慎重に 5.5 mL 15 %iodixanol ソリューション (図 1 b) 以下 25 %iodixanol ソリューションのレイヤー (遠心管の首が従来のピペットの狭すぎる) と非卒業のパスツール ピペットを使用します。注:これは正常にパスツール ピペット 2 mL 程度保持できるので、3 つのステップで、iodixanol を追加することによって実現できます。 40% と 60% の iodixanol ソリューション 2.9.3 の手順で説明するように追加します。レイヤーの中に異なる iodixanol のインターフェイスが不可でした。注:異なる iodixanol 分数の適切な準備は、(表 1の指示を参照してください) iodixanol の分数に追加フェノールレッドのおかげで視覚的に確認して確保できます。各分画は特定の密度があるので彼らが混ぜ合わせないように階層化段階では、それが正しく実行される場合 (図 1をチェック)。 パスツール ピペット 15 %iodixanol の勾配上に lysate の原油を層します。ライセートの原油と iodixanol ソリューション間のインターフェイスを脅かさないよう滴ずつを進みます。 半月板に達する超遠心法 (図 1) の中に生成された非常に高い力の下でチューブがつぶれないように管首の付け根まで、遠心管を換散バッファーでいっぱい。 適切な蓋を用いた遠心管を閉じます。すべての 3 つの遠心管が同じ重みを持っていることを確認するデジタル スケールを使用します。’原油ライセート’ の上に多くの換散バッファーを追加して、必要に応じて重量を調整します。注:遠心チューブの重量の違いは、超遠心機の安全な操作を確保するため 0.1 g 以下なりません。Ultracentrifuges は機器の危険性のある部分を適切に訓練された人員のみが使用する必要があります。 301,580 x でg加速と減速の最大速度を使用して 12 の ° C で 1 時間 40 分の固定角度チタン ロータを使用してチューブを遠心します。 慎重に 40% と 60 %iodixanol インターフェイスでステンレス鋼の鈍針を挿入します。 針を 5 mL シリンジ (図 1E) に接続します。 ベクトル粒子を含む明確な一部分だけを吸い出しなさい。注:収集総体積は約 2.5-3 mL です。これにより、非望ましい蛋白質の存在のための最終的なベクトルのバッチで汚染のレベル以来の 25-40% インターフェイスからの材料のコレクションを避けてください。 フラクション (脱塩および濃度) を処理または一晩 4 ° C で保存 図 1: iodixanol の勾配の精製とその後のベクトル コレクションのセットアップ。(A) 別の円錐管にピペット iodixanol の各ソリューションの適切なボリュームの異なる iodixanol の勾配遠心管にピペットで移す前、に。パスツールを使用 (B)、ピペットの順番に各 iodixanol のソリューションを遠心管に転送する: 前のレイヤーの下にチューブの下部に iodixanol のますます高い濃度のレイヤーを追加する必要があります。(C) 層原油ベクトル上一度グラデーション lysate を準備されています。このベクトル コレクション システムでは、’ 針刺しのリスクが発生する鋭い針は使用しません。(D) A ステンレス鋼 316 注射針が 40/60 %iodixanol インターフェイスまで iodixanol の勾配によって挿入されます。(E) ベクトル粒子 40 %iodixanol の段階で発見され、収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 3. 脱塩、AAV ベクターの濃度 注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは約 2 時間かかります。 4,000 x gで 5 mL の PBS MK と 5 分間遠心する x 1 を追加することによって遠心フィルターのフィルター膜を prerinse します。 1 つの x の 5 mL を追加し AAV ベクター フラクションに PBS MK ミックスし、フィルターに総量を追加。1 x の添加によって PBS-MK、濁度が観察されます。円錐形フィルターの現在のボリュームまで 4,000 x gで遠心は 1 mL に削減されています。外部コレクションの管に蓄積された流れを破棄します。 (最小 3 x) を必要な回数として円錐形フィルターと遠心分離の繰り返しに PBS MK ステップ 1 x の 13 mL を追加、そこまでがより多く濁りのない観察されたとき新鮮な 1 × PBS MK が追加されます。 最終的にステップを洗って、300-350 μ L にボリュームが小さくなるまで、4,000 x gで PBS + 0.01% (v/v) 非イオン性界面活性剤および遠心分離機の 13 mL を追加します。 フィルターの存在の残りの部分を収集するには、ボリューム全体を滅菌スカート微量遠心チューブにピペッティングします。注:この画分には、脱塩、濃縮 AAV のベクトルが含まれています。このプロトコルの次の手順では、この割合を「プライマリ」の割合と呼びます。フードの下で管を処理して 4 ° C で保存することを確認します。 1 の 200 μ L でフィルターを洗浄フィルターに保持, 残差ベクトル粒子を収集する PBS MK x。滅菌遠心チューブに収集します。注:これは下ベクトル抗体を必要とするいくつかのアプリケーションに適した希釈ベクトル在庫です。今後の手順では、この割合を ‘セカンダリ分数と呼びます。 短期的なストレージ 4 ° C (2 週間以内) でのベクトル fraction(s) に格納します。因数とストア-20 ° C の長期保存が必要な場合のベクトル。 セクション 4 で説明されているように、品質管理を実行します。 4 量的なポリメラーゼの連鎖反応によるベクトルの滴定 注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 3 時間かかります。 標準曲線 セクション 1 の HEK 293 t 細胞のトランスフェクションに使用される遺伝子発現プラスミド (pTransgene) をリニア化します。 0.5 mL 遠心チューブに制限のダイジェスト ミックスを準備 (制限のダイジェスト ミックスの組成について表 2を参照)。注:使用される酵素および製造業者から関連のガイドラインによると制限のダイジェスト ミックスの組成を調整します。 37 ° C で 1 時間制限のダイジェスト ミックスを孵化させなさい プラスミドの 1 h. 完全な消化のため 100 V で 0.8% (w/v) agarose のゲルの線形プラスミッドを実行して、制限の消化力の効率は、定義されたサイズの 1 つのフラグメントを作り出すべきであるを確認します。 線形プラスミッド DNA PCR 精製キットを使用して次の製造元の手順24を浄化し、分光光度計で 260 で吸収を測定することによって DNA 濃度の測定 nm。滴定後、さらに使用するための-20 ° C で線形プラスミッドの残りの因数を格納します。 1 マイクロリットルあたりプラスミド ストックの分子 (すなわち DNA コピー) を次のように計算します。 まず、プラスミッドの分子の重量を計算します。DNA 塩基対 (bp) の平均体重は 650 ダルトン (Da)、bp の 1 モルの重さ 650 g と仮定すると、製品長さ (bp) の塩基対あたりの重量で二本鎖 DNA テンプレートの分子量を推定できます。プラスミッドの分子の重量 [g/mol] = プラスミド サイズ [bp] x 650 [ダ/bp] 次に、プラスミド 1 マイクロリットルあたりのモル数を計算します。1 マイクロリットルあたりプラスミドのモル = プラスミド濃度 [g/μ L]/プラスミッドの分子の重量 [g/mol]注:分子量の逆は、プラスミド 1 g の原料に存在のモル数です。 アボガドロ数 (6.022 × 1023分子/ほくろ) を使用して、1 マイクロリットルあたりプラスミッドの分子数を計算します。1 マイクロリットルあたりプラスミッドの分子プラスミド アボガドロ数 [分子/ほくろ] x [モル/μ L] 1 マイクロリットルあたりのモルを = 最後に、1 x 109分子 (1 マイクロリットルあたりゲノム (vg) ベクトル) の必要な濃度 100 μ L のソリューションを取得するプラスミド ストック (分子/μ L) を希釈します。プラスミド ストック (100 μ L) = (望ましい集中 [分子/μ L] × 100 μ L)/プラスミッドの分子 [分子/μ L] トリプリケートでプラスミド ストック (1 x 10 の9英領バージン諸島/μ L) のシリアル希薄を行います。1 x 109英領バージン諸島/μ L プラスミド ストック + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 108 vg/μ L ソリューション1 x 108 vg/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 107英領バージン諸島/μ L ソリューション1 x 107英領バージン諸島/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 106 vg/μ L ソリューション1 x 106 vg/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 105 vg/μ L ソリューション1 x 101英領バージン諸島/μ L ソリューションを取得し続けます。 QPCR プレート (セクション 4.3) にそれらを読み込むまで氷の上標準プラスミド ストックのシリアル希薄を保ちます。 コンポーネント 量 制限酵素バッファー x 10 5 Μ L 制限酵素 2, 5 Μ L プラスミド 5 μ g H2O 50 μ L まで 表 2: 制限のダイジェストのミックスの組成物。 テーブル 3: 在庫プラスミド巻電卓。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。 AAV ベクターからの DNA 抽出 ミックス 2 μ L、AAV のベクトル ストック (ステップ 3.5 からプライマリ、分数) DNase の 198 μ L で私はストリップ管 (PCR チューブ) (1 x) をバッファーし、DNase の 2 μ L を追加私。注:DNase (これは qPCR 結果を歪める) ベクトル カプシド内に含まれていない任意の遺伝物質を低下します。このソリューションは、希釈 ’10-2x dil1′ と呼ばれます。 95 ° C で 10 分間続いて、37 ° C で 30 分間インキュベートします。注:プロトコルをこの時点で停止することができます、4 ° C で無期限に材料を格納する製品劣化を避けるためにすることができます。 10-2 x dil1ソリューション (ステップ 4.2.1) にプロティナーゼ K の 2 μ L を追加し、95 ° C で 20 分続いて 50 ° C で 60 分間インキュベート注:この手順は、AAV ベクター キャプシドを分解、ソリューションに AAV ベクター ゲノムがリリースされます。蛋白質のサンプルの内容 (カプシド) は知られていない、過剰にプロテイナーゼ K を追加します。注意してください、確実にプロティナーゼ K のすべての活動が最終的な結果に影響を及ぼす (部分的な) ポリメラーゼ劣化との問題を避けるために変性、qPCR、前にによって削除が不可欠です。 1:10 1.5 mL 遠心チューブにプロテイナーゼ K 処理10-2 x dil1ソリューション (ステップ 4.2.3) のシリアル希薄とおりの準備します。10-2 x dil1 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = x 10-3 dil1希釈10-3 x dil1 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 10-4x dil1希釈10 μ L of 10-4 x dil1 + H2O の 90 μ L = 10-5 x dil1希釈 QPCR プレート (セクション 4.3) にそれらを読み込むまで氷の上ベクトルから抽出した DNA のシリアル希薄を維持します。 SYBR グリーン検出ベース qPCR による滴定 サンプルおよび標準の両方の 1.5 mL 遠心チューブに qPCR マスター ミックスを準備します。SYBR グリーン マスター ミックス、前方プライマー (在庫 10 μ M)、逆プライマー (10 μ M 株式) の 1 μ L と H2O 反応あたり 3 μ L の 1 μ L の 10 μ L を使用します。表 4のプライマー シーケンスのプロトコルを参照してください。 QPCR マスター ミックスを上下、ピペットしますが、ボルテックスにかけないでください。 セクション 4.1 で作製した標準曲線のいずれかの 5 μ L またはセクション 4.2、各ウェルに AAV のベクトルから抽出した DNA に続いて、qPCR マスター ミックスの 15 μ L を追加します。のみ、qPCR マスター ミックス、ネガティブ コントロールとしてを含む 3 つの井戸があります。プレート レイアウト、図 2を参照してください。 シール フィルムでプレートを封印し、遠心分離機で 1,500 × g 30 qPCR プレートの簡潔に 4 ° C で s QPCR 反応をプレート ベース リアルタイム PCR 増幅と検出の計測器で、表 5に提案した条件を使用して実行します。 プライマー名 シーケンス 前方のプライマー 5′-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3′ 逆プライマー 5′-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3’ 表 4: プライマー シーケンス CBA プロモーターに対して設計されています。 図 2: qPCR のベクターの滴定用プレート レイアウトします。サンプルが色分けされている: 緑 = 標準曲線青 = H2O 制御;グレー = プライマリ端数オレンジ = 二次分数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 ステップ 時間 温度 サイクル 目的 中古インキュベーション 5 分 95 ° C x1 DNA の変性およびポリメラーゼの活性 (ホット スタート反応)。 増幅 10 分 95 ° C x1 DNA の増幅。異なる熱処理温度で代替のプライマーを使用している場合、設定を最適化可能性があります。 10 s 95 ° C x40 40 s 60 ° C 1 s 72 ° C 冷却 10 s 40 ° C x1 プレートの冷却します。PCR の終わり。 表 5: SYBR グリーン ベースの qPCR の滴定のための熱サイクリングのプロトコル。 AAV ベクター価を決定するためのデータ分析 標準的な曲線を生成するセクション 4.1 で調製した標準試料の異なる希釈率で得られた Ct 値をスプレッドシートのデータ セル (表 6 a) を入力します。注意: 標準の曲線の方程式が表示されます (y = ln (x) + b) 一緒にR2効率 (表 6 b)。100% に近い効率と R2 1.0 (≥ 0.96) に近い、qPCR が必要です。 Aとbの計算値を使用して、スプレッドシート (表 6) に対応するデータのセルに記入します。 セクション 4.2 で調製した AAV 試料の異なる希釈率で得られた Ct 値をスプレッドシートを完了します。 次の数式を使用してベクトル ゲノム ‘一次分数’ の 1 マイクロリットルあたり平均の AAV ベクター価を計算します。注: 係数 400 は単一の孤立したゲノム用が sc のゲノムを使用して 200 の倍率25。実際、DNA 量各 qPCR サイクル中にダブル DNA は sc は、ss のゲノムと比較して 2 倍を検出しました。滴定の目的は 1 マイクロリットルあたりベクトル ゲノムの観点から濃度を計算します。補正は、qPCR の実行開始材料 (ステップ 4.2.1) の 2 μ L を使用するときに必要です。ディルは、4.2.4 のステップから希釈倍率を表します。’セカンダリ AAV ベクター画分 (ステップ 3.6) の抗体価を同時に計算できます。 表 6: qPCR データ分析のテンプレート。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。 5. 純度制御 SDS-PAGE および銀製の汚損 注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 5 時間かかります。 エタノール 70% (v/v) を使用して、ゲルを鋳造に使用するガラス板を徹底的にきれいにします。 ゲルの鋳造システムを組み立てます。ゲルをキャストするときにアクリルアミドの混合物の漏洩を防ぐため、ガラス板の底を欠損なくことを確認します。 スタッキング、2 つの別の 50 mL の円錐管に解決のゲル ソリューションを準備します。彼らはゲルの重合に関与、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) と 10% (w/v) アンモニウムの過硫酸塩 (APS) を省略します。すぐにゲルを鋳造する前にそれらを追加します。注:ゲル中のアクリルアミドの最終的な割合に影響を与えるタンパク質の分離プロファイル: 通常、アクリルアミド濃度 10% (v/v) 最後は AAV ベクター準備の純度をテストするのに十分になります。 ゲル成分を含むチューブを旋回で優しく混ぜます。過剰な酸素は、重合を損なうことができるので、ない渦を行います。 TEMED と 10% (w/v) APS 解決のゲル ソリューションに追加します。ミックスし、1-2 cm 以下の小さなガラス プレートの上部に到達するまで、その後ゲル ホルダーに注ぐ。 アクリルアミドの混合物の上に水飽和ブタノール層を配置します。これは重合中に平らな面の形成になります。これはゲルを脱水し、その機能を損なうよう 30 分以上アルコールの下でゲルを放置しないでください。注意: ブタノールは皮膚に接触した場合危険です。また、火災リスクを生じます。取り扱いに注意。 ゲル重合し、その後、ブタノールを注ぐを待ちます。ヒント: は、チューブで余分なジェル ミックスが凝固したかどうかを確認します。重合は H2O とゲルの未満 20 分洗浄表面で発生し、ゲルの表面を邪魔しないように世話ペーパー タオルを使って乾かします。 TEMED と 10% (w/v) APS にスタッキングのゲルを加えて分離ゲルの上にゲル ホルダーにゲルを注ぎなさい。 ゲルに付属の櫛を配置します。井戸の中の空気の泡の形成を避けるために 1 つの安定した動きで操作を実行します。 ゲル重合に少なくとも 20 分待ちます。ヒント: 円錐管が凝固した余分なジェルに混ぜる場合チェックしてください。 (表 7) の 2 つのミックスを備えると、プライマリとセカンダリの AAV ベクター画分 (ステップ 3.5、3.6、それぞれ)。 高い金額 量が少ない AAV ベクター素材 5 Μ L 1 Μ L サンプル バッファー x 5 3 Μ L 3 Μ L H2O 7 Μ L 11 Μ L 表 7: 組成は銀染色に必要なサンプル ミックス。 完全にそれらを 95 ° C で 5 分間加熱することによってサンプル ミックスを変化させなさい。電極の向きに注意を払って、電気泳動槽を組み立てます。 1 x 電極アセンブリの中の陰極バッファーと外側に陽極バッファー x 1 タンクを埋めます。注: 陽極バッファーは実行するからリサイクルすることができます。新鮮な陰極バッファーは、常に使用する必要があります。 ゲルから櫛を削除し、1 x 陰極バッファーでゲルの井戸を清掃します。 井戸の中の蛋白質の梯子の 1 μ L をロードします。同じゲル (図 3) でさまざまな坑井でサンプル ミックスをロードします。サンプル解決のゲルを入力まで 50 V でゲルを実行します。染料前ゲルの下限に達するまで 100 V に電圧を増やしてください。 ゲルをガラス板から慎重に抽出して銀染色キット (製造元の指示26) によると AAV キャプシドを構成するウイルス蛋白質 (VP1、VP2 と VP3 サブユニット) 可能なを確認します。蛋白質の汚染 (図 3)。 図 3: SDS-PAGE および銀製の汚損を使用してベクトルの純度評価します。トリシン SDS ゲルを使用すると、様々 なベクトルの準備の 5 μ L を分離しました。タンパク質はその後銀染色により検出されました。ベクトル純粋と見なされますとき VP1 (82 kDa)、VP2 (67 kDa) と VP3 (60 kDa) が 1:1 で表示されます: 10 比 (1 車線)、過剰な背景 (2 車線) または無指定バンド (3 車線) なし。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。