Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .
Outils de livraison de gène issus des virus adéno-associés (AAVs) sont un choix populaire pour la livraison des transgènes au système nerveux central (CNS), y compris les applications de la thérapie génique. Des vecteurs d’AAV sont non répliquées, capable d’infecter des cellules en division et non de division et de fournir l’expression transgénique à long terme. Ce qui est important, certains sérotypes, tels que le PHP nouvellement décrit. B, peut traverser la sang-encéphalique (BHE) dans des modèles animaux, après délivrance systémique. Des vecteurs d’AAV peuvent être efficacement produites en laboratoire. Cependant, les protocoles robustes et reproductibles sont tenus d’obtenir des vecteurs d’AAV avec des niveaux suffisants de pureté et de valeurs titre suffisamment élevées pour des applications in vivo . Ce protocole décrit une stratégie efficace et reproductible pour la production de vecteur AAV, basée sur une stratégie de purification gradient d’iodixanol. La méthode de purification iodixanol est adaptée pour l’obtention de lots de vecteurs AAV haut-titre de haute pureté, par rapport aux autres méthodes de purification. En outre, le protocole est généralement plus rapide que les autres méthodes actuellement décrites. En outre, une quantitative polymerase chain réaction (qPCR)-basé de stratégie est décrite pour la détermination rapide et précise de la titre de vecteur, ainsi qu’une méthode de coloration à l’argent déterminer la pureté du lot vector. Enfin, des résultats représentatifs de l’injection de gène dans le SNC, suite à l’administration systémique d’AAV-PHP. B, sont présentés. Ces résultats devraient être possibles dans tous les laboratoires utilisant les protocoles décrits dans cet article.
Au cours des 30 dernières années, AAVs sauvage ont été conçus pour créer des vecteurs d’AAV recombinants, qui sont sont avérées pour être des outils extrêmement utiles pour le transfert de gène dans les CNS1,2,3,4, 5,6 et la thérapie génique s’approche de la maladie (y compris les thérapies et EMA-approuvé par la FDA)4,7. Leur aptitude à l’emploi dans le système nerveux central provient en grande partie de leur capacité à infecter des cellules post-mitotiques, non de division, on trouve généralement dans le CNS8. Cependant, les vecteurs AAV-basés ont également l’avantage de permettre une expression à long terme de toute donnée de transgènes thérapeutiques4,9 , tout en suscitant une réponse immunitaire plus douce par rapport aux autres vecteurs viraux7, 8,10,11,12.
Les principaux éléments d’un vecteur AAV sont le génome et la capside. AAVs sauvage sont monocaténaires (ss) virus à ADN avec un génome d’environ 5 kilobases (kb)13. Pour la production des vecteurs d’AAV recombinants, les gènes de rep et de cap (nécessaires pour la réplication du génome et l’assemblage de la capside virale) sont supprimés à partir du génome de l’AAV sauvage et prévues en trans, laissant la place à une cassette d’expression contenant le transgène14,15. Les ordres terminaux répétition inversées (ITRs) du génome viral initial sont les seuls éléments conservés dans un vecteur AAV, car celles-ci sont essentielles pour la réplication et l’emballage de3,10,14. Des vecteurs d’AAV peuvent être conçues pour amplifier l’expression du transgène ; une mutation dans l’un de l’ITRs conduit à la formation d’une boucle en épingle à cheveux qui effectivement permet la génération d’un ADN complémentaire brin3,7,15. Le principal avantage de cette configuration, appelée un génome complémentaires (sc), est qu’il contourne la nécessité pour la synthèse du deuxième brin typique dans le cycle de vie classique de AAVs, augmentant considérablement la vitesse et les niveaux d’expression de transgènes 1. Néanmoins, à l’aide d’un génome de scAAV réduit la capacité de chargement du vecteur à environ 2,4 kb. Cela inclut des séquences de transgène, ainsi que des séquences régulatrices telles que des promoteurs ou des sites de liaison de micro-ARN, afin de limiter l’expression de types spécifiques de cellules16.
La capside AAV détermine l’interaction de cellule hôte-vecteur et confère un niveau de tropisme cellulaire de type ou de tissu pour un sérotype AAV, qui peut également être exploitée afin de limiter l’expression du transgène à des emplacements spécifiques. Plusieurs sérotypes d’AAV sont trouvent dans la nature, tandis que d’autres ont été produites dans des laboratoires à travers des approches recombinants (c.-à-d., PHP. B). en outre, certains capsides confèrent également autres caractéristiques utiles, telles que la capacité à traverser la BHE, résultant dans la prestation des transgènes dans tout le système nerveux central après administration systémique. Ceci a été démontré pour la AAV9, ainsi que pour le PHP récemment décrit. B capside17. En conséquence, ces sérotypes sont avèrent particulièrement pertinentes pour de nouvelles approches de thérapie génique pour neurodégénératives troubles1,17,18.
Le but du présent protocole est de décrire une méthode rentable pour la production à petite échelle des vecteurs d’AAV avec titre élevé et la pureté. Bien que les résultats présentés ici utilisent le PHP. B capside et une cassette d’expression scAAV, le protocole est convenable pour la production de plusieurs sérotypes de vecteur d’AAV et configurations de génome, ce qui permet une flexibilité maximale expérimentale. Toutefois, le rendement de vecteur et de la pureté finale peuvent varier selon le sérotype choisi.
Le protocole lui-même est une variante de la méthode de tri-transfection classique pour la production de vecteurs viraux et incorpore l’utilisation d’un gradient d’iodixanol pour vecteur nettoyage, qui, par rapport à l’utilisation classique de gradients de césium de chlorure (CsCl), a été rapporté des vecteurs d’AAV de pureté supérieure à un temps plus efficace manière19,20,21.
Les étapes de la transfection, purification et concentration sont destinées à être effectuées selon les bonnes pratiques de laboratoire (bpl) dans un laboratoire de culture tissulaire conçu au travail vecteur viral. Chaque tâche doit être exécutée en conformité avec la législation locale et nationale concernant la production de vecteurs viraux et utiliser. Travail doit être effectué sous une hotte à flux laminaire et dans des conditions stériles. À l’intérieur de l’installation de vecteur, il est recommandé de porter un tablier de laboratoire, en plus de la blouse de laboratoire réguliers de culture tissulaire. Par ailleurs, une double paire de gants, ainsi que les couvre-chaussures en plastique, il faut porter en tout temps.
Avant de commencer la production de vector, s’assurer que tout l’équipement nécessaire et plasmides sont disponibles. 1) pCapsid plasmide contient le gène rep qui encode quatre protéines non structurelles nécessaires pour la réplication, à savoir Rep78, Rep68, Rep52 et Rep40 et le gène de la PAC qui encode les trois protéines de la capside structurelle, à savoir VP1, VP2 et VP3. 2) pHelper plasmide contient les gènes E4, E2Aet VA de l’adénovirus, qui facilitent la production de cellules HEK293T AAV. 3) pTransgene plasmide contient la cassette d’expression de transgènes, flanquée de deux RTI. Ces plasmides peuvent être synthétisés de novo dans le laboratoire à l’aide de séquences disponibles en ligne22. Pour les plasmides, faites de novo, surtout ceux contenant des transgènes roman, séquençage est nécessaire, pour s’assurer que le transgène et la RTI est corrects. Alternativement, premade plasmides peuvent être directement acquises par le biais de dépôts de plasmide en ligne. Lorsque cela est nécessaire, les plasmides peuvent être amplifiés et purifié à l’aide de kits standard, selon instructions23 les directives du fabricant.
Titre de vecteur et de la pureté peuvent compromettre la capacité de transduction du vecteur. Protocoles additionnels sont fournis pour évaluer la qualité du produit vecteur. Les vecteurs finales sera utiles pour l’étude de la fonction de cellule de CNS dans des applications aussi bien in vitro et in vivo .
La production des vecteurs d’AAV recombinants décrite ici utilise des matériaux et équipements communs à la plupart des laboratoires de biologie moléculaire et des installations de culture de cellules. Il permet à l’utilisateur d’obtenir des vecteurs d’AAV pure, précliniques de qualité qui peuvent être utilisés pour cibler plusieurs types de cellules et de tissus dans un éventail d’applications in vitro et in vivo . Un des plus grands avantages du présent protocole, par rapport aux autres (p. ex., axée sur le CsCl purification), est le plus court temps de travail nécessaire. Prêt-à-utiliser des vecteurs d’AAV peuvent être obtenus dans un délai maximum de 6 jours ouvrables après la transfection initiale de cellules HEK293T.
Plusieurs facteurs peuvent influencer négativement le rendement final ou la qualité du vecteur AAV. Efficacité de transfection pauvre est l’une des principales raisons pour un faible rendement virale33. Une recommandation majeure est l’utilisation de cellules HEK293T qui n’ont pas été repiquées plus de 20 fois et n’ont pas une confluence de cellule supérieure à 90 % au moment de la transfection21. En outre, la méthode de transfection sélectionnée a un impact majeur sur les résultats. Ce protocole est basé sur l’utilisation du PEI. PEI est un polymère cationique avec la capacité de livrer des ADN exogène dans le noyau de la cellule grâce à la génération des complexes de polymère et d’acide nucléique, appelée polyplexes, qui sont absorbés par la cellule et les victimes de la traite par endosomes34. Transfection axée sur le PEI est facile et rapide à réaliser, contrairement aux autres méthodes répandues, comme la coprécipitation d’ADN avec le phosphate de calcium,35. Aussi, transfection axée sur le PEI est beaucoup moins cher par rapport aux autres méthodes nouvellement introduites, telles que l’utilisation des lipides cationiques et36de la transfection induite par l’aimant.
La stratégie de purification joue un rôle clé dans le protocole. Par rapport aux autres méthodes, axée sur l’iodixanol des purifications ont tendance à contiennent un pourcentage plus élevé de particules virales vides (20 %),20. Cela est compensé, dans une certaine mesure, par le fait qu’axée sur l’iodixanol purification résulte systématiquement dans les préparations de vecteur AAV avec un ratio de particules à l’infectivité inférieur à 100. Il s’agit d’une amélioration significative par rapport aux procédures conventionnelles CsCl-basé, pour lesquels une perte substantielle d’infectiosité de la particule est signalé37. Une autre méthode alternative commune à épurer des vecteurs d’AAV est axée sur la chromatographie en phase de purification. Toutefois, cette méthode a l’inconvénient majeur qu’une colonne spécifique est requise pour chaque capside vecteur utilisé : par exemple, tandis que AAV2 est classiquement isolées à l’aide de colonnes de l’héparine, cette méthode ne fonctionne pas avec AAV4 et AAV5, qui ne possèdent pas de liant l’héparine sites sur leurs capsides38. Considérant que la purification par chromatographie est aussi cher, axée sur l’iodixanol purification est généralement plus adaptée pour les laboratoires qui désirent se produire des lots de haute qualité des vecteurs d’AAV sur une petite échelle33,39, 40. Toutefois, afin de maximiser le rendement final et la pureté du vecteur, un soin extrême est nécessaire lors des gradients d’iodixanol. Les diverses fractions d’iodixanol devraient être transférées à l’ultracentrifugation tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile dont l’extrémité est en contact avec la paroi du tube : iodixanol devrait être expulsé de la pipette lentement et continuellement. Comme les particules de vecteur s’accumulent dans la couche d’iodixanol de 40 %, soins doivent être prises pour s’assurer que les interfaces dégradés ne mélangent pas20. Enfin, la fraction contenant le vecteur devrait être recouvrée par l’insertion d’une aiguille émoussée en acier inoxydable avec un calibre ne dépassant pas 20 G. Pour maximiser la récupération de vecteur, la fraction claire doit être récupérée dans son intégralité. Au cours de cette étape, le timing est critique. Pour ne pas compromettre la pureté de la préparation, il est essentiel d’arrêter la collection avant la collecte des autres phases (contamination) du dégradé.
Différences dans le titre de vecteur obtenus peuvent être attribuées aussi à la capacité intrinsèque du vecteur pour produire des particules emballés. Une comparaison entre différents sérotypes d’AAV a montré que certains vecteurs AAV sont plus difficiles à produire à un titre plus élevé que d’autres (p. ex., AAV2)41. Précipitation du vecteur, pendant l’étape de dessalement, peut être une raison possible pour un titre plus faible et facilement prévenue en évitant la surconcentration33. En outre, il est également possible que l’efficacité de la purification d’axée sur le gradient iodixanol diffère légèrement entre sérotypes et, par conséquent, divergences dans le titre obtenu avec des sérotypes différents sont observés en41.
Enfin, il doit être souligné que, même si qPCR est une méthode très précise pour la quantification de l’ADN certaine variabilité inhérente à la technique peut être observée. Précision dans le titrage dépend principalement le pipetage précis et bonne agitation de toutes les solutions. Afin de garantir le titre plus précis de lecture, le qPCR peut être indépendamment répété, et les valeurs obtenues en moyenne. Le choix des amorces présentées dans le présent protocole est basé sur la séquence du promoteur ABC situé dans le plasmide pTransgene utilisé dans notre laboratoire. Le promoteur de l’ABC est un ardent promoteur synthétique qui est largement utilisé dans le champ de vecteurs d’expression en voiture à travers plusieurs types de cellules. Il incorpore plusieurs éléments, y compris l’élément de l’enrichisseur début cytomégalovirus (CMV) ; le promoteur, premier exon et le premier intron du gène ABC ; et l’accepteur d’épissage de la β-globine de lapin. Cependant, les amorces peuvent être conçus pour pratiquement n’importe quel élément situé à l’intérieur de la cassette d’expression (y compris le promoteur, transgène et des éléments réglementaires). La comparaison du titre dans l’ensemble de lots est également possible, fournir des amorces sont utilisés contre les régions communes pour les vecteurs en question.
En conclusion, ce protocole peut être utilisé pour produire des vecteurs d’AAV avec une variété de capsides, configurations de génome, types de promoteur et cargaisons de transgene. Cela permettra aux utilisateurs d’adapter facilement les caractéristiques finales de leurs vecteurs pour satisfaire au mieux les besoins expérimentaux. Dans l’exemple présenté dans les résultats représentatifs, l’utilisation de PHP. Capside de B, qui traverse la BHE efficacement, a donné l’expression des gènes très efficace dans le SNC, suivant queue veine injection32. L’administration systémique de vecteurs par ressuage CNS a des avantages considérables en termes d’effets secondaires possibles de17,2,32. Une alternative possible à injection périphérique, tout en évitant les mises en garde des techniques invasives, est intrathécale, qui se compose de la livraison du vecteur AAV dans le liquide céphalo-rachidien. Cet itinéraire de livraison est avéré efficace, montrant une expression très répandue du transgène à travers le système nerveux central, moins d’effets hors-cible dans les organes périphériques et de faibles niveaux de réponse immunitaire42. Toutefois, des injections intrathécales sont beaucoup plus difficiles, car ils exigent des compétences plus techniques que l’injection dans la veine queue.
Perfectionnement de capside pour affiner cette technologie sera pilotée par les possibilités d’utilisation de vecteurs AAV dans les applications de la thérapie génique. Ces approches offrent des possibilités attrayantes pour traiter les troubles du SNC actuellement incurables, comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth maladie, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer18.
The authors have nothing to disclose.
M.R. est pris en charge par un Fonds voor bourse postdoctorale Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) et reconnaît l’appui continu de la Fundación cardiovasculaire de Colombie et du département des sciences administratives, La technologie et l’Innovation (subvention CT-FP44842-307-2016, le code de projet 656671250485). M.M. est soutenu par une bourse de doctorat de FWO (1S48018N). M.G.H. était soutenu par une subvention institutionnelle du VIB et le soutien extérieur du Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), la fondation d’Alzheimer Research (SAO-FRA) (P #14006), le FWO (Grant 1513616N) et le Conseil européen de recherche (CER) (Starting Grant 281961 – AstroFunc ; Preuve de Concept Grant 713755 – AD-VIP). Les auteurs remercient Jeason Haughton pour son aide avec l’élevage de souris, Stephanie Castaldo pour son aide à effectuer les injections de veine de queue et Caroline Eykens pour fournir les images de cellules HEK293T transfectées. M.G.H. reconnaît Michael Dunlop, Peter Hickman et Dean Harrison.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |