人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径
Summary
白氨酸丰富的重复激酶2基因（LRRK2）的突变导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简单可靠的方法，用于评估人类外周血中Rab10的LRRK2控制磷酸化。这可能有助于识别具有增加LRRK2激酶通路活性的个人。
Abstract
白细胞丰富的重复激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常见的突变基因，所有致病性LRRK2突变导致其激酶功能过度活化。在这里，我们描述了一种简单而可靠的测定方法，通过测量其生理基质之一Rab10的生理基质之一Rab10，以量化人类外周血神经中粒体中的LRRK2激酶通路活性。所述的免疫印迹分析需要完全选择性和磷特异性抗体，能够识别LRRK2对Rab10 Thr73表皮磷酸酯，如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。它使用人类外周血嗜中性粒细胞，因为外周血很容易获得，嗜中性粒细胞是丰富和同质的成分。重要的是，嗜中性粒细胞表示LRRK2和Rab10的较高水平。嗜中性粒细胞的潜在缺点是其高内在丝氨酸蛋白酶活性，这需要使用非常有效的蛋白酶抑制剂，如有机磷神经毒素二氟磷酸二磷酸二磷酸（DIFP）作为淋索缓冲液的一部分。然而，嗜中性粒细胞是研究LRRK2激酶在体内活性的宝贵资源，应考虑纳入PD生物库收集。
Introduction
减缓或阻止帕金森病（PD）的尝试迄今都失败了。在白细胞富重复激酶2（LRRK2）中发现超活化突变，导致和/或增加PD的风险，导致LRRK2激酶抑制剂11，2，32,3的发展。这些已经进入临床试验4。LRRK2的确切功能尚不清楚，但一个重大的进步是确定一个子集的Rab GTPase蛋白，包括Rab10，作为LRRK2激酶55，6，76,7的第一个真正的生理基质。在疾病改变治疗时代的主要挑战是LRRK2激酶激活状态的生化标记物和LRRK2激酶抑制剂的目标参与。
到目前为止，LRRK2抑制剂体内的主要药代动力学标记物是LRRK2的一组磷酸化血清残留物，特别是丝氨酸935，这些残留物因对不同的LRRK2抑制剂88、99而变得脱磷化。然而，丝氨酸935磷酸化与内在细胞LRRK2激酶活性无关，因为它不是LRRK2直接磷酸化，并且仍然磷酸化在激酶不活性LRRK210。LRRK2激酶活性与丝氨酸1292的自磷酸化密切相关，但实际来说，由于目前该站点10、11,11缺乏可靠和磷特异性抗体，因此，通过免疫blot分析整细胞提取物，它不是内源性LRRK2激酶活性的合适读出。
我们开发了一种强健且易于测定的测定方法，用于量化人类外周血细胞中的LRRK2激酶通路活性，测量其生理目标蛋白Rab10在threonine 7311的LRRK2控制磷酸化。外周血很容易通过单月切除，这是一个低风险和快速的程序，导致最小的不适。我们专注于人类外周血嗜中性粒细胞，因为它们构成丰富的（占所有白细胞的37-80%）和同质细胞群，表示相对较高的LRRK2和Rab1011水平。此外，外周血嗜中性粒细胞可以通过采用免疫磁阴性方法快速有效地分离。为了确保随后观察到的Rab10磷酸化由LRRK2介导，每批嗜中性粒细胞都孵育有或没有强效和选择性的LRRK2激酶抑制剂（我们使用并推荐MLi-2）2，12。2,12然后，在含有蛋白酶抑制剂二丙酸酯磷酸（DIFP）的缓冲液中细胞水解，这是抑制内生氨酸蛋白酶活性所必需的，已知在中性粒细胞中含量高13。对于定量免疫印迹的最终分析，我们建议使用MJFF-pRab10兔子单克隆抗体，专门检测Rab10 Thr73-磷脂蛋白，并且不与其他磷酸化的Rab蛋白14发生交叉反应。这种抗体的选择性和特异性已验证在不同的Rab蛋白和A549 Rab10敲出细胞系14的过度表达模型。因此，我们测量了使用和未经过强效和选择性LRRK2激酶抑制剂2治疗的中性粒细胞中Rab10磷酸化的差异。或者，也可以通过其他方法（如定量质谱法）分析样品。
最后，LRRK2控制的Rab10磷酸化是LRRK2激酶活性对935号丝氨酸LRRK2磷酸化的优越标志，人类外周血嗜中性粒细胞是PD研究LRRK2的宝贵资源。我们的协议提供了一个强大和容易的测定，以查询LRRK2途径活性在外周血神经中，并允许生物化学分层的人与增加LRRK2激酶活性15。重要的是，这些个体可能受益于未来的LRRK2激酶抑制剂治疗。
Protocol
Representative Results
Discussion
令人信服的临床、遗传和生化证据表明LRRK2具有重要作用，尤其是其激酶在帕金森病中的作用7。LRRK2激酶抑制剂已经开发，并进入临床试验22，4，12。4,12因此，需要利用LRRK2作为生物标志物，用于目标参与和患者分层。我们的协议描述了一个强大和容易的测定，用于分析LRRK2激酶途径激活，其生理基质Rab10在人?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢健康志愿者为本研究献血。我们感谢迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会（MJFF）和福克斯生物网研究领导（FBN）对书面协议和视频的支持和投入。我们感谢奥地利维也纳大学的亚历山大·津普里奇教授测试我们的协议和合作。我们重视保罗·戴维斯对项目的贡献（MRC PPU总经理）。我们还认可MRC蛋白磷酸化和泛化单元（PPU）的出色技术支持，即化学合成（纳塔利娅·什皮罗合成MLi-2）、MRC PPU试剂和服务抗体净化团队（协调希拉里·麦克劳赫兰和詹姆斯·哈斯蒂）。我们感谢来自Vivomotion的MhairiTowler和弗雷泽·默多克在制作视频和动画方面的帮助。我们感谢来自81部电影的史蒂夫·索夫协助进行最后的编辑。埃丝特·萨姆勒由苏格兰高级临床学术奖学金资助，并接受了英国帕金森氏症（K-1706）的资助。
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
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