ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות¹. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ’ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.

חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם ³⁵התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג’ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג’י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של^2,O מקושרים glycans³. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג’ל מרחביות-דף⁴. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה^{4,5,6, 7}.

כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ’ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.

שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ’ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.

לצ’ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ’ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד ³⁵S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.

הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי ³⁵התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.

למרות מתיונין ³⁵S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם ³⁵S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ’ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.