Se ha descrito un protocolo detallado para la purificación y posterior análisis posterior de un anticuerpo monoclonal a partir del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF) de microbiorreactores automatizados. También se presenta el uso de análisis para determinar los atributos de calidad críticos (CQA) y maximizar el volumen de muestra limitado para extraer información vital.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son uno de los productos biológicos más populares y bien caracterizados fabricados hoy en día. La mayoría de las células de ovario de hámster chino (CHO), las condiciones de cultivo y proceso deben optimizarse para maximizar los títulos de anticuerpos y lograr perfiles de calidad objetivo. Normalmente, esta optimización utiliza biorreactores automatizados a microescala (15 ml) para examinar varias condiciones de proceso en paralelo. Los criterios de optimización incluyen el rendimiento del cultivo y los atributos de calidad críticos (CQA) del producto de anticuerpos monoclonales (mAb), que pueden afectar su eficacia y seguridad. Las métricas de rendimiento del cultivo incluyen el crecimiento celular y el consumo de nutrientes, mientras que los CQA incluyen los perfiles de n-glicosilación y agregación del mAb, variantes de carga y peso molecular. Este protocolo detallado describe cómo purificar y posteriormente analizar las muestras de HCCF producidas por un sistema automatizado de microbiorreactores para obtener valiosas métricas de rendimiento y salidas. En primer lugar, se utiliza un método automatizado de cromatografía líquida de proteína sin proteínas (FPLC) para purificar el mAb de las muestras de cultivo celular cosechadas. Una vez concentrados, los perfiles glicanos son analizados por espectrometría de masas utilizando una plataforma específica (consulte la Tabla de Materiales). Los pesos moleculares de anticuerpos y los perfiles de agregación se determinan utilizando cromatografía de exclusión de tamaño-dispersión de luz angular múltiple (SEC-MALS), mientras que las variantes de carga se analizan utilizando electroforesis de zona capilar de microchip (mCZE). Además de las métricas de rendimiento del cultivo capturadas durante el proceso del biorreactor (es decir, viabilidad del cultivo, recuento celular y metabolitos comunes, como glutamina, glucosa, lactato y amoníaco), se analizan los medios gastados para identificar los nutrientes limitantes mejorar las estrategias de alimentación y el diseño general del proceso. Por lo tanto, también se describe un protocolo detallado para la cuantificación absoluta de aminoácidos por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de medios gastados. Los métodos utilizados en este protocolo aprovechan las plataformas de alto rendimiento que son compatibles con un gran número de muestras de pequeño volumen.
Las terapias con proteínas se utilizan para tratar una creciente variedad de condiciones médicas, incluyendo complicaciones de trasplante de tejido, trastornos autoinmunes y cánceres1. Desde 2004, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (USFDA) ha documentado una proporción cada vez mayor de solicitudes de licencias biológicas (BLA) de todas las aprobaciones reguladas por el Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER), y los BLA representan más del 25% en 2014 y 20152.
Teniendo en cuenta este mercado en expansión, los fabricantes de productos biofarmacéuticos se enfrentan al desafío de entregar rápidamente más productos con una calidad constante. Los esfuerzos para aumentar el rendimiento de los productos se han centrado en la ingeniería celular CHO y el cribado de líneas de producción, aunque las mejoras más significativas se deben a los avances en la optimización de la estrategia de medios/alimentación y los controles ambientales del cultivo celular1, 3 , 4 , 5 durante el proceso de fabricación.
Dado que los mAbs se producen en un sistema biológico, puede haber variabilidad proteica inherente. La composición de anticuerpos puede alterarse después de la traducción, como la glicosilación o afectada por la degradación o las reacciones enzimáticas. Estas variaciones estructurales pueden provocar reacciones inmunitarias peligrosas o alterar la unión de anticuerpos, lo que a su vez puede reducir o eliminar la función terapéutica prevista5. Por lo tanto, los atributos de calidad crítica (CQA) de anticuerpos monoclonales – perfil De N-glicano, distribución de variantes de carga y el porcentaje de anticuerpos en forma monomérica – se supervisan y controlan regularmente como parte de un enfoque de Calidad por Diseño (QbD) durante el procesos de fabricación1,6. En un entorno de producción regulado, las proteínas terapéuticas deben cumplir los criterios de aceptación para obtener una licencia como medicamento comercial aprobado7. Los métodos presentados aquí serían típicamente parte del procesode caracterización de calidad para un anticuerpo 7,8,y cualquier científico de proteínas estará familiarizado con su uso.
En eltrabajo anterior 9, se ha descrito la aplicación y operación de microbiorreactores para el cribado de alto rendimiento de las condiciones de cultivo celular en el bioprocesamiento ascendente. El producto purificado obtenido a partir de las diferentes condiciones de los medios se somete a análisis de N-glicano utilizando LC-MS. Los patrones de glicosilación de proteínas terapéuticas pueden detectarse y caracterizarse utilizando las técnicas LC-MS10,11,y la la presencia de varias especies de glicanos se ha relacionado con parámetros de bioprocesos como la estrategia de alimentación, el pH y la temperatura12. El efecto de las diferentes condiciones de los medios en la calidad del producto, indicado por el porcentaje de la IgG resultante en forma monomérica, también se evalúa con Cromatografía de Exclusión de Tamaño- Dispersión de Luz Multi-Angle (SEC-MALS)13,14 , 15. El perfil de variante de carga representa una serie de modificaciones16 que podrían afectar a la función de un producto. La electroforesis de zona microcapilar (mCZE) es una técnica que ofrece un tiempo de análisis considerablemente más rápido en comparación con los métodos de cromatografía de intercambio de cationes tradicionales (CEX) y enfoque isoeléctrico capilar (cIEF) utilizados para el análisis de variantes de carga17 ,18. Se analizaron los medios de biorreactor gastados para realizar un seguimiento del consumo de aminoácidos durante la producción de proteínas en relación con los cambios en los atributos identificativos del anticuerpo19,20,21,22 , 23.
El análisis de proteínas nos permite identificar parámetros críticos del proceso (CCP) en función de las relaciones entre las entradas del proceso y los cambios en los CQA. Durante el desarrollo de bioprocesos, la identificación y medición de CPPs demuestra fundamentalmente el control del proceso y garantiza que el producto no ha cambiado, lo que es esencial en entornos de fabricación altamente regulados. En este artículo, se presentan técnicas analíticas para medir algunas de las características bioquímicas de la proteína más pertinente para los CQA del producto (perfil de Glicano, variantes de carga y homogeneidad de tamaño).
HCCF contiene escombros y partículas grandes que pueden obstruir y destruir la costosa instrumentación, por lo que se necesita una aclaración del cultivo antes de un procesamiento posterior. La centrifugación es generalmente el primer enfoque para separar las células y otras partículas insolubles de las proteínas seguidas de la filtración. Este HCCF filtrado se somete entonces a cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) para su purificación. La purificación de HCCF a partir de microbiorreactores automatizados para obtener el producto es un paso importante en el procesamiento posterior. Aquí, un sistema FPLC de sobremesa con una columna de proteína A se utiliza para obtener anticuerpos monoclonales del HCCF. Los análisis para procesos ascendentes pueden proporcionar información útil sobre el comportamiento celular y guiar el diseño de bioprocesos, lo que ayuda a obtener un producto de calidad coherente y confiable. Analytics también nos permite vincular atributos de calidad crítica (CQA) a procesos ascendentes y descendentes. Aquí se presentan cuatro ensayos que se utilizan comúnmente en la caracterización de anticuerpos monoclonales. Estas técnicas son robustas, fiables y fácilmente desplegables para el análisis de procesos y productos de una variedad de fuentes ascendentes que sólo se purifican parcialmente y todavía pueden contener niveles residuales de ADN y HCP.
Al limpiar muestras para análisis, se debe alcanzar un equilibrio importante entre la creación de una muestra lo suficientemente limpia para el análisis y la preservación de la variabilidad presente en el biorreactor. Los dos contaminantes más comunes que afectan al producto son el ADN y el HCP, que se pueden comprobar midiendo la absorbancia de la relación a 260/280 nm y a través de SDS-PAGE o éCE-SDS. Los ensayos presentados aquí no son sensibles a los bajos niveles de contenido de ADN. La pureza del producto es >95% pura, según lo determinado por el CE-SDS.
El análisis de variantes de carga con un sistema de electroforesis microcapilar proporciona un método de alto rendimiento para identificar variantes de carga, con chips y reactivos que son relativamente fáciles de implementar. La naturaleza de la técnica y la química del reactivo de etiquetado son sensibles a los excipientes y otras aminas primarias, lo que requiere un paso de desalación para la mayoría de las matrices de muestras. Por experiencia, los bajos niveles de ADN co-migran con el tinte libre de la reacción de etiquetado y no afectan la calidad de los resultados. Mientras que la variabilidad de la cuantificación de picos básicos, principales y ácidos es típicamente <1%, niveles más altos de ADN y otros contaminantes pueden aumentar la variabilidad del ensayo. Es extremadamente importante ser consistente con el etiquetado de proteínas y asegurar el uso rápido de DMF después de la eliminación de la botella y ser mezclado con el tinte. Las normas de lisina y/o histidina se recomiendan como controles de etiquetado. Con el tiempo y dependiendo de la calidad de la muestra, las virutas pueden ensuciar o perder el recubrimiento en los canales microfluídicos, lo que conduce a un mayor ruido, la presencia de picos fantasma y una mayor variación de muestra a muestra. Para identificar esta ocurrencia, se analizaron simultáneamente con las muestras los espacios en blanco y un estándar de idoneidad del sistema (es decir, NISTmAb) con las muestras a intervalos regulares. Cuando surgen problemas de chip, las virutas se pueden lavar con la solución de almacenamiento o reemplazarse.
Los métodos utilizados para el análisis de glicanos de glicoproteínas terapéuticas implican principalmente cromatografía líquida (LC) y/o espectrometría de masas (MS), con análisis de microarray de lectina ganando popularidad como tercera opción25. El método descrito en este documento utiliza LC y MS, que tiene beneficios y desventajas. Los métodos espectrométricos de masatienen la ventaja de la verificación masiva de los glicanos analizados, lo que no es posible con métodos basados en LC que utilizan una salida de detección fluorescente o microarrays de lectina. Este método utiliza LC y detección de fluorescencia para asignar identidades de glicano mediante la comparación de tiempo de retención con un estándar de escalera de dextran. El monitoreo de fluorescencia permite una mayor sensibilidad y cuantificación debido a la facilidad de su detección, donde la MUS por sí sola podría no ser capaz de cuantificar especies de baja abundancia debido a la baja eficiencia de ionización de los oligosacáridos. La información masiva de MS se utiliza para confirmar identidades de glicano, pero el software de procesamiento no utiliza la información de masas como criterios de asignación principal. Por lo tanto, sin cromatografía reproducible y picos fácilmente resueltas, este método puede sufrir con respecto a las asignaciones de glicanos. Afortunadamente, la información de masa puede ayudar con las asignaciones de glicano incluso en situaciones en las que la cromatografía es deficiente, como cambios en el tiempo de retención que dificultan las asignaciones de glicanoreproducibles. Si este método se utiliza sin EM, la cromatografía debe estar en el nivel más alto, ya que la información de masa no se puede utilizar para corregir la desviación del tiempo de residencia.
El método de análisis de aminoácidos descrito aquí utiliza LC-MS para la cuantificación rápida de aminoácidos no derivatizados en medios de cultivo celular crudo. Los métodos alternativos de análisis de aminoácidos requieren agentes de derivación de aminoácidos para permitir la detección UV26. El método LC-MS ofrece importantes ventajas sobre el método LC-UV: permite la identificación basada tanto en el tiempo de retención como en la masa iónial en comparación con el método LC-UV, que está limitado por la falta de caracterización de masa. Además, el método LC-MS ofrece ventajas de tiempo y reproducibilidad, ya que el método LC-UV requiere una reacción de derivación que consume mucho tiempo, que puede impartir variabilidad de la muestra27. Sin embargo, la inyección de medios de cultivo celular crudo en el método LC-MS puede causar efectos perjudiciales en la señal de LA MS debido a la suciedad del skimmer iónico. Una escalera de calibración se inyecta con frecuencia como una comprobación de idoneidad del sistema, y el orden de la muestra se aleatoriza para evitar sesgos en los datos.
El proceso de cultivo celular para la producción de anticuerpos utilizando microbiorreactores se describe previamente9. En este estudio, los protocolos detallados para los métodos de caracterización de anticuerpos monoclonales que maximizan los datos adquiridos a partir de volúmenes de muestra limitados están bien definidos. Las cantidades limitadas de líquido de cultivo celular cosechado a veces pueden restringir la información del producto adquirida y la selección de los procedimientos analíticos adecuados para obtener datos de calidad del producto es esencial. Los análisis son importantes para vincular los parámetros del proceso ascendente con los cambios en la calidad del producto. Aquí, se proporciona una guía para que los usuarios caractquen mAbs cuando trabajen con microbiorreactores.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quieren agradecer a Scott Lute por el apoyo analítico que brindó. El Programa de Ruta Crítica del CDER (CA #1-13) proporciona financiamiento interno parcial y apoyo a esta labor. Este proyecto es apoyado en parte por un nombramiento para el Programa de Participación en Pasantías/Investigación en la Oficina de Productos Biotecnológicos, Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |