자동화된 미생물반응기의 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 단일클론 항체의 정제 및 후속 분석을 위한 상세한 프로토콜이 기술되었다. 분석을 사용하여 중요한 품질 특성(CQA)을 결정하고 제한된 샘플 볼륨을 최대화하여 중요한 정보를 추출하는 것도 제공됩니다.
단일 클론 항체 (mAbs)는 오늘날 제조 된 가장 인기 있고 잘 특성이있는 생물학적 제품 중 하나입니다. 가장 일반적으로 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하여 생산, 배양 및 공정 조건은 항체 적기를 최대화하고 목표 품질 프로파일을 달성하기 위해 최적화되어야한다. 일반적으로 이러한 최적화는 자동화된 마이크로스케일 바이오리액터(15mL)를 사용하여 여러 공정 조건을 병렬로 스크리핑합니다. 최적화 기준에는 배양 성능과 단일클론 항체(mAb) 제품의 중요한 품질 특성(CQA)이 포함되며, 이는 그 효능 및 안전성과 에 영향을 미칠 수 있습니다. 배양 성능 메트릭은 세포 성장 및 영양소 소비를 포함하며, CQA에는 mAb의 N-글리코실화 및 응집 프로파일, 전하 변이체 및 분자량이 포함됩니다. 이 상세한 프로토콜은 자동화된 미생물 기체 시스템에서 생성된 HCCF 샘플을 정화하고 분석하여 귀중한 성능 메트릭 및 출력을 얻는 방법을 설명합니다. 첫째, 자동화된 단백질 A 고속 단백질 액상 크로마토그래피(FPLC) 방법은 수확된 세포 배양 샘플로부터 mAb를 정화하는 데 사용된다. 일단 집중되면, 글리칸 프로파일은 특정 플랫폼을 사용하여 질량 분석법에 의해 분석됩니다 (재료 표참조). 항체 분자량 및 응집 프로파일은 크기 배제 크로마토그래피-다중 각도 광 산란(SEC-MALS)을 사용하여 결정되며, 전하 변이체는 마이크로칩 모세관 영역 전기 영동(mCZE)을 사용하여 분석됩니다. 생물반응기 과정 동안 포착된 배양 성능 메트릭(즉, 배양 생존가능성, 세포 수 및 글루타민, 포도당, 락테이트 및 암모니아를 포함한 일반적인 대사산물) 이외에, 소비된 배지는 제한적인 영양소를 식별하기 위해 분석된다. 공급 전략 및 전반적인 공정 설계를 개선할 수 있습니다. 따라서, 소비된 매체의 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)에 의한 아미노산의 절대 정량화를 위한 상세한 프로토콜도 설명된다. 이 프로토콜에 사용되는 방법은 많은 수의 소량 샘플에 호환되는 높은 처리량 플랫폼을 활용합니다.
단백질 치료제는 조직 이식 합병증, 자가면역 질환 및 암 1을 포함하는증가하는 다양한 의료 조건을 치료하는 데 사용되고 있다. 2004년부터 미국 식품의약국(USFDA)은 약물 평가 및 연구 센터(CDER)가 규제하는 모든 승인의 생물학적 라이선스 신청(BLA)의 비율이 증가하고 있으며, BLA가 25% 이상을 차지하고 있습니다. 2014 년과 2015 년2.
이러한 시장 확대를 고려할 때, 바이오 제약 제조업체는 일관된 품질로 더 많은 제품을 신속하게 제공하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 제품 수율을 높이기 위한 노력은 CHO 세포 공학 및 생산 라인 스크리닝에 초점을 맞추고 있지만, 가장 중요한 개선사항은 미디어/사료 전략 최적화 및 세포 배양 환경 제어의 발전에 기인합니다1. 3개 , 4개 , 5 제조 공정 중.
mAb는 생물학적 시스템에서 생산되기 때문에 고유의 단백질 가변성이 있을 수 있습니다. 항체 조성물은 글리코실화와 같은 번역 후 변경되거나 분해 또는 효소 반응에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 구조적 변이는 위험한 면역 반응을 유발하거나 항체 결합을 변화시킬 수 있으며, 이는 차례로 의도된 치료 기능5를감소 또는 제거할 수 있다. 따라서, 단일 클론 항체의 중요한 품질 특성 (CQA) – N-글리칸 프로파일, 전하 변이체 분포 및 단일체 형태의 항체의 백분율 – 동안 품질 별 설계 (QbD) 접근법의 일부로 정기적으로 모니터링되고 제어됩니다. 제조공정 1,6. 규제 된 생산 환경에서 치료 단백질은 승인 된 상용 의약품7로허가되기 위해 수용 기준을 충족해야합니다. 본 명세서에 제시된 방법은 전형적으로 항체7,8에대한 품질 특성화 과정의 일부가 될 것이며, 임의의 단백질 과학자는 그들의 사용에 익숙할 것이다.
이전 작업9에서, 업스트림 바이오프로세싱에서 세포 배양 조건의 높은 처리량 스크리닝을 위한 미생물 반응기의 적용 및 작동이 설명되었다. 다양한 매체 조건에서 얻은 정제생성물은 LC-MS 를 이용한 N-글리칸 분석을 행하고 치료단백질의 글리코실화 패턴을 검출하고 LC-MS 기술10,11,및 다양한 글리칸 종의 존재는 사료 전략, pH 및 온도12와같은 생물 공정 매개 변수와 연결되었습니다. 결과 IgG의 백분율로 단조로운 형태로 표시된 제품 품질에 대한 다양한 미디어 조건의 영향은 또한 크기 배제 크로마토그래피- 다각형 광 산란(SEC-MALS)13,14로 평가됩니다. , 15. 충전 변형 프로파일은 제품의 기능에 영향을 줄 수있는 여러 가지 수정 사항16을 나타냅니다. 미세 모세관 영역 전기 영동 (mCZE)은 전하 변이체 분석 (17)에 사용되는 기존의 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 및 모세관 등전 초점 (cIEF) 방법에 비해 상당히 빠른 분석 시간을 제공하는 기술입니다. ,18. 항체의 식별 속성19,20,21,22의 변화와 관련하여 단백질 생산 중 아미노산 소비를 추적하기 위해 생체 반응기 매체를 분석했습니다. , 23.
단백질 분석을 통해 공정 입력과 CQA의 변경 간의 관계를 기반으로 중요한 공정 파라미터(CCP)를 식별할 수 있습니다. 생물 공정 개발 중에 CPP를 식별하고 측정하는 것은 공정 제어를 근본적으로 입증하고 제품이 변경되지 않았는지 확인하며, 이는 규제가 엄격한 제조 환경에서 필수적입니다. 이 백서에서는 제품 CQA(N-글리칸 프로파일, 전하 변이체 및 크기 균질성)와 가장 관련이 있는 단백질의 생화학적 특성 중 일부를 측정하는 분석 기술이 제시된다.
HCCF에는 비용이 많이 드는 계측을 막고 파괴할 수 있는 이물질과 큰 입자가 포함되어 있으므로 추가 다운스트림 처리 전에 배양 설명이 필요합니다. 원심분리는 일반적으로 여과 에 이어 단백질에서 세포 및 기타 불용성 입자를 분리하는 첫 번째 접근법입니다. 이러한 여과된 HCCF는 정제를 위해 빠른 단백질 액상 크로마토그래피(FPLC)를 실시합니다. 제품을 얻기 위해 자동화 된 미생물 반응기에서 HCCF의 정제는 다운 스트림 처리에 중요한 단계입니다. 여기서, 단백질 A 컬럼을 가진 벤치탑 FPLC 시스템은 HCCF로부터 단일클론 항체를 얻기 위해 사용된다. 업스트림 프로세스에 대한 분석은 세포 거동에 대한 유용한 통찰력을 제공하고 생물 공정 설계를 안내하여 일관되고 신뢰할 수 있는 품질의 제품을 얻을 수 있도록 도와줍니다. 또한 분석을 통해 중요한 품질 특성(CQA)을 업스트림 및 다운스트림 프로세스에 연결할 수 있습니다. 여기에서 제시된 단클론 항체의 특성화에서 일반적으로 이용되는 4개의 비약은. 이러한 기술은 부분적으로만 정제되고 DNA 및 HCP의 잔류 수준을 포함할 수 있는 다양한 업스트림 소스의 공정 및 제품 분석을 위해 강력하고 신뢰할 수 있으며 쉽게 배포할 수 있습니다.
분석을 위해 샘플을 청소할 때 는 생물 반응기의 가변성을 유지하면서 분석을 위해 충분히 깨끗한 샘플을 만드는 것 사이에 중요한 균형을 맞추어야 합니다. 제품에 영향을 미치는 두 가지 가장 일반적인 오염 물질은 DNA와 HCP이며, 260/280 nm에서 비흡도를 측정하고 SDS-PAGE 또는 μCE-SDS를 통해 확인할 수 있습니다. 여기에서 제시된 검사는 DNA 내용의 낮은 수준에 과민하지 않습니다. 제품의 순도는 μCE-SDS에 의해 결정된 바와 같이 >95% 순수합니다.
미세 모세관 전기 영동 시스템을 이용한 전하 변이체 분석은 상대적으로 구현하기 쉬운 칩과 시약으로 전하 변종을 식별하는 높은 처리량 방법을 제공합니다. 기술의 본질과 라벨시약의 화학은 부형제 및 기타 1차 아민에 민감하므로 대부분의 시료 매트릭스에 대해 탈염 단계가 필요합니다. 경험에서, DNA의 낮은 수준은 라벨 링 반응에서 자유 염료와 함께 마이그레이션하고 결과의 품질에 영향을 미치지 않습니다. 기본, 주 및 산성 피크 정량화의 가변성은 전형적으로 <1%, DNA 및 기타 오염 물질의 상부는 분석의 가변성을 증가시킬 수 있습니다. 단백질 라벨링과 일치하고 병에서 제거하고 염료와 혼합 한 후 DMF를 신속하게 사용하는 것이 매우 중요합니다. Lysine 및/또는 히스티딘 표준 라벨링 컨트롤로 권장 됩니다. 시간이 지남에 따라 샘플 품질에 따라 칩은 미세 유체 채널에서 코팅을 파울하거나 잃어 더 큰 소음, 고스트 피크의 존재 및 샘플 간 변형을 더 많이 발생시킬 수 있습니다. 이러한 발생을 식별하기 위해 블랭크 및 시스템 적합성 표준(즉, NISTmAb)을 정기적으로 샘플과 동시에 분석했습니다. 칩 문제가 발생하면 칩을 저장 솔루션으로 세척하거나 교체할 수 있습니다.
치료용 당단백질의 글리칸 분석에 사용되는 방법은 주로 액체 크로마토그래피(LC) 및/또는 질량 분석법(MS)을 포함하며, 렉틴마이크로어레이 분석은 제3의 옵션25로 인기를 얻고 있습니다. 이 문서에서 설명하는 방법은 장점과 단점이 있는 LC와 MS를 모두 사용합니다. 질량 분광 방법은 형광 검출 출력 또는 렉틴 마이크로어레이를 사용하는 LC 기반 방법으로는 불가능한 분석된 글리칸의 질량 검증의 장점이 있다. 이 방법은 LC 및 형광 검출을 사용하여 dextran 사다리 표준에 대한 보존 시간 비교를 사용하여 글리칸 ID를 할당합니다. 형광 모니터링은 MS만으로는 올리고당의 이온화 효율이 좋지 않아 낮은 풍부도종을 정량화하지 못할 수 있는 검출의 용이성으로 인해 감도 및 정량화를 증가시킴을 허용합니다. MS의 대량 정보는 글리칸 ID를 확인하는 데 사용되지만 처리 소프트웨어는 대용량 정보를 기본 할당 기준으로 사용하지 않습니다. 따라서 재현 가능한 크로마토그래피와 쉽게 해결할 수 있는 피크가 없으면 이 방법은 글리칸 할당과 관련하여 어려움을 겪을 수 있습니다. 다행히도 질량 정보는 크로마토그래피가 하위인 상황에서도 재현 가능한 글리칸 할당을 방해하는 보존 시간의 변화와 같은 상황에서도 글리칸 할당에 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 MS 없이 사용하는 경우, 질량 정보를 사용하여 체류 시간 드리프트를 수정할 수 없기 때문에 크로마토그래피는 가장 높은 수준에 있어야 합니다.
여기서 설명된 아미노산 분석 방법은 조세포 배양 배지에서 과소화된 아미노산의 신속한 정량화를 위해 LC-MS를 활용한다. 대체 아미노산 분석 방법은 UV 검출26을가능하게 하는 아미노산 유도제를 필요로 한다. LC-MS 방법은 LC-UV 방법에 비해 중요한 이점을 제공합니다: 질량 특성화의 부족에 의해 제한되는 LC-UV 방법과 는 반대로 체류 시간 및 이온 질량을 모두 기반으로 식별할 수 있습니다. 더욱이, LC-MS 방법은 시간 및 재현성 이점을 제공하며, LC-UV 방법은 시료 가변성(27)을 부여할 수 있는 시간 소모적 유도반응을 필요로 한다. 그러나, LC-MS 방법에서 조세포 배양 배지의 주입은 이온 스키머 파울링으로 인한 MS 신호에 해로운 영향을 미칠 수 있다. 교정 사다리는 시스템 적합성 검사로 자주 주입되며, 데이터의 편향을 방지하기 위해 샘플 순서가 무작위화됩니다.
미생물을 이용한 항체 생산을 위한 세포 배양공정은 앞서 9. 이 연구에서는 제한된 샘플 볼륨에서 수집된 데이터를 최대화하는 단일 클론 항체 특성 화 방법에 대한 상세한 프로토콜이 잘 정의되어 있습니다. 수확된 세포 배양 액의 양이 제한되어 때때로 획득된 제품 정보를 제한할 수 있으며 제품 품질 데이터를 얻기 위한 올바른 분석 절차의 선택이 필수적입니다. 분석은 업스트림 프로세스 매개변수를 제품 품질의 변화에 연결하는 데 중요합니다. 여기서, 사용자가 미생물 반응기로 작업 할 때 mAbs를 특성화할 수있는 지침이 제공됩니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 그가 제공 한 분석 지원에 대한 스콧 루테에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 부분적인 내부 자금 지원 및 지원은 CDER 중요 경로 프로그램(CA #1-13)에 의해 제공됩니다. 이 프로젝트는 오크 리지 과학 교육 연구소가 관리하는 미국 식품 의약국(FDA)의 생명 공학 제품 사무소에서 인턴십/연구 참여 프로그램을 통해 부분적으로 지원됩니다. 미국 에너지부와 FDA 간의 기관 간 계약을 체결할 수 있습니다.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |