Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind eines der beliebtesten und am besten charakterisierten biologischen Produkte, die heute hergestellt werden. Am häufigsten mit chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO) Zellen hergestellt werden, Muss Kultur und Prozessbedingungen optimiert werden, um Antikörper-Titter zu maximieren und Zielqualitätsprofile zu erreichen. In der Regel verwendet diese Optimierung automatisierte Mikroskalen-Bioreaktoren (15 ml), um mehrere Prozessbedingungen parallel zu überprüfen. Zu den Optimierungskriterien gehören die Kulturleistung und die kritischen Qualitätsattribute (CQAs) des monoklonalen Antikörperprodukts (mAb), die sich auf seine Wirksamkeit und Sicherheit auswirken können. Kulturleistungsmetriken umfassen Zellwachstum und Nährstoffverbrauch, während die CQAs die N-Glykosylierungs- und Aggregationsprofile des mAb, Ladungsvarianten und Molekulargewicht umfassen. Dieses detaillierte Protokoll beschreibt, wie HCCF-Proben, die von einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem erzeugt werden, gereinigt und anschließend analysiert werden, um wertvolle Leistungsmetriken und -ausgänge zu erhalten. Zunächst wird ein automatisiertes Protein-A-Methode zur schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) verwendet, um das mAb aus geernteten Zellkulturproben zu reinigen. Einmal konzentriert, werden die Glykinprofile mittels Einer bestimmten Plattform durch Massenspektrometrie analysiert (siehe Materialtabelle). Antikörper-Molekulargewichte und Aggregationsprofile werden mittels Größenausschlusschromatographie-Multiple-Winkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) bestimmt, während Ladungsvarianten mittels Mikrochip-Kapillarzonenelektrophorese (mCZE) analysiert werden. Zusätzlich zu den Kulturleistungsmetriken, die während des Bioreaktorprozesses erfasst wurden (d. h. Kulturlebensfähigkeit, Zellzahl und häufige Metaboliten wie Glutamin, Glukose, Laktat und Ammoniak), werden verbrauchte Medien analysiert, um verbesserung der Fütterungsstrategien und des gesamten Prozessdesigns. Daher wird auch ein detailliertes Protokoll zur absoluten Quantifizierung von Aminosäuren durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) verbrauchter Medien beschrieben. Die in diesem Protokoll verwendeten Methoden nutzen Plattformen mit hohem Durchsatz, die für eine große Anzahl von Samples mit kleinem Volumen kompatibel sind.
Protein-Therapeutika werden verwendet, um eine wachsende Vielfalt von Erkrankungen zu behandeln, einschließlich Gewebetransplantation Komplikationen, Autoimmunerkrankungen, und Krebs1. Seit 2004 dokumentiert die United States Food and Drug Administration (USFDA) einen steigenden Anteil an bioologischen Lizenzanträgen (BLAs) aller zulassungen, die vom Center for Drug Evaluation and Research (CDER) reguliert werden, wobei BLAs über 25 % der Zulassungen ausmachen. 2014 und 20152.
Angesichts dieses expandierenden Marktes sind biopharmazeutische Hersteller gefordert, schnell mehr Produkte mit gleichbleibender Qualität zu liefern. Die Bemühungen, die Produktausbeute zu steigern, konzentrierten sich auf CHO-Zelltechnik und Produktionslinien-Screening, obwohl die wichtigsten Verbesserungen auf Fortschritte bei der Optimierung der Medien-/Feed-Strategie und der Umgebungskontrollen für Zellenkulturen zurückzuführen sind1, 3 , 4 , 5 während des Herstellungsprozesses.
Da mAbs in einem biologischen System hergestellt werden, kann es eine inhärente Proteinvariabilität geben. Die Antikörperzusammensetzung kann posttranslational verändert werden, z. B. glykosyliert oder durch Abbau oder enzymatische Reaktionen beeinflusst werden. Diese strukturellen Variationen können gefährliche Immunreaktionen hervorrufen oder die Antikörperbindung verändern, was wiederum die beabsichtigte therapeutische Funktion reduzieren oder eliminieren kann5. Daher werden kritische Qualitätsattribute (CQAs) monoklonaler Antikörper – N-Glykanprofil, Ladungsvariantenverteilung und der Anteil der Antikörper in monomerer Form – regelmäßig im Rahmen eines Quality by Design (QbD)-Ansatzes während der Herstellungsprozesse1,6. In einem regulierten Produktionsumfeld müssen therapeutische Proteine die Akzeptanzkriterien erfüllen, um als zugelassenes kommerzielles Arzneimittel zugelassen zu werden7. Die hier vorgestellten Methoden wären in der Regel Teil des Qualitätscharakterisierungsprozesses für einen Antikörper7,8, und jeder Proteinwissenschaftler wird mit ihrer Verwendung vertraut sein.
In früheren Arbeiten9wurde die Anwendung und der Betrieb von Mikrobioreaktoren für das Hochdurchsatzscreening von Zellkulturbedingungen in der vorgelagerten Bioverarbeitung beschrieben. Das aus den unterschiedlichen Medienbedingungen gewonnene gereinigte Produkt wird einer N-Glykan-Analyse mit LC-MS unterzogen. Glykosylierungsmuster von therapeutischen Proteinen können mit den LC-MS-Techniken10,11und Das Vorhandensein verschiedener Glykanarten wurde mit Bioprozessparametern wie Futterstrategie, pH-Wert und Temperatur12in Verbindung gebracht. Die Auswirkungen der unterschiedlichen Medienbedingungen auf die Produktqualität, angegeben durch den Prozentsatz des resultierenden IgG in monomerer Form, werden auch mit Größenausschlusschromatographie- Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)13,14 , 15. Das Ladungsvariantenprofil stellt eine Reihe von Modifikationen16 dar, die sich auf die Funktion eines Produkts auswirken könnten. Die Mikrokapillarzonenelektrophorese (mCZE) ist eine Technik, die eine wesentlich schnellere Analysezeit im Vergleich zu herkömmlichen Kationenaustausch(CEX)-Chromatographien und kapillaren isoelektrischen Fokussierungsmethoden (cIEF) bietet, die für die Chargenvariantenanalyse verwendet werden17 ,18. Verbrauchte Bioreaktormedien wurden analysiert, um den Aminosäureverbrauch während der Proteinproduktion zu verfolgen, da sie sich auf Veränderungen der identifizierenden Eigenschaften des Antikörpers beziehen19,20,21,22 , 23.
Proteinanalysen ermöglichen es uns, kritische Prozessparameter (CPPs) basierend auf den Beziehungen zwischen Prozesseingaben und Änderungen in CQAs zu identifizieren. Während der Bioprozessentwicklung demonstriert die Identifizierung und Messung von CPPs grundsätzlich die Prozesssteuerung und stellt sicher, dass sich das Produkt nicht verändert hat, was in stark regulierten Fertigungsumgebungen unerlässlich ist. In diesem Beitrag werden Analysetechniken zur Messung einiger biochemischer Eigenschaften des Proteins vorgestellt, das am relevantesten für Produkt-CQAs (N-Glykanprofil, Ladungsvarianten und Größenhomogenität) ist.
HCCF enthält Schmutz und große Partikel, die kostspielige Instrumente verstopfen und zerstören können, so dass eine Kulturklärung vor der weiteren Weiterverarbeitung erforderlich ist. Zentrifugation ist im Allgemeinen der erste Ansatz, um Zellen und andere unlösliche Partikel von Proteinen zu trennen, gefolgt von Filtration. Dieser gefilterte HCCF wird dann zur Reinigung der Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) unterzogen. Die Reinigung von HCCF aus automatisierten Mikrobioreaktoren zur Gewinnung des Produkts ist ein wichtiger Schritt in der Weiterverarbeitung. Hier bei der Gewinnung monoklonaler Antikörper aus dem HCCF wird ein Tisch-FPLC-System mit einer Protein-A-Säule verwendet. Analysen für upstreame Prozesse können nützliche Einblicke in das Zellverhalten bieten und das Bioprozessdesign leiten und so zu einem konsistenten und zuverlässigen Qualitätsprodukt beitragen. Analytics ermöglicht es uns auch, Kritische Qualitätsattribute (CQAs) mit vor- und nachgelagerten Prozessen zu verknüpfen. Hier werden vier Assays vorgestellt, die häufig bei der Charakterisierung monoklonaler Antikörper verwendet werden. Diese Techniken sind robust, zuverlässig und für Prozess- und Produktanalysen aus einer Vielzahl von vorgelagerten Quellen, die nur teilweise gereinigt werden und noch Restmengen an DNA und HCP enthalten können, leicht einsetzbar.
Bei der Reinigung von Proben für Analysen muss ein wichtiges Gleichgewicht zwischen der Erstellung einer Probe, die für die Analyse ausreichend sauber ist, und der Erhaltung der Im Bioreaktor vorhandenen Variabilität gefunden werden. Die beiden häufigsten Kontaminanten, die sich auf das Produkt auswirken, sind DNA und HCP, die durch Messung der Verhältnisabsorption bei 260/280 nm und durch SDS-PAGE oder CE-SDS überprüft werden können. Die hier vorgestellten Assays reagieren nicht empfindlich auf niedrige DNA-Gehalte. Die Reinheit des Produktes ist >95% rein, wie durch die Definition von CE-SDS bestimmt.
Die Chargenvariantenanalyse mit einem mikrokapillaren Elektrophoresesystem bietet eine Methode mit hohem Durchsatz, um Ladungsvarianten mit Chips und Reagenzien zu identifizieren, die relativ einfach zu implementieren sind. Die Art der Technik und die Chemie des Etikettierungsreagenzsindsind sind sowohl empfindlich gegenüber Hilfsstoffen als auch anderen primären Aminen, was für die meisten Probenmatrixen einen Entsalzungsschritt erfordert. Erfahrungsgemäß wandern niedrige DNA-Werte mit dem Freifarbstoff aus der Etikettierungsreaktion und beeinflussen nicht die Qualität der Ergebnisse. Während die Variabilität der Grund-, Haupt- und Saurier-Spitzenquantifizierung in der Regel <1% beträgt, können höhere DNA-Spiegel und andere Verunreinigungen die Variabilität des Tests erhöhen. Es ist äußerst wichtig, mit der Proteinkennzeichnung konsistent zu sein und die schnelle Verwendung von DMF nach dem Entfernen aus der Flasche und dem Mix mit dem Farbstoff sicherzustellen. Lysin- und/oder Histidin-Standards werden als Etikettierkontrollen empfohlen. Im Laufe der Zeit und abhängig von der Probenqualität können Chips die Beschichtung auf den Mikrofluidienkanälen verunreinigen oder verlieren, was zu größerem Rauschen, dem Vorhandensein von Geisterspitzen und einer größeren Variation von Probe zu Probe führt. Um dieses Vorkommen zu identifizieren, wurden Inlädiele und ein Systemeignungsstandard (z.B. NISTmAb) in regelmäßigen Abständen gleichzeitig mit den Proben analysiert. Wenn Chipprobleme auftreten, können die Chips mit der Speicherlösung gewaschen oder ersetzt werden.
Die Methoden für die Glykananalyse von therapeutischen Glykoproteinen betreffen in erster Linie flüssige Chromatographie (LC) und/oder Massenspektrometrie (MS), wobei die Lectin-Mikroarray-Analyse als dritte Option an Popularität gewinnt25. Die in diesem Dokument beschriebene Methode verwendet sowohl LC als auch MS, was Vor- und Nachteile hat. Massenspektrometrische Methoden haben den Vorteil der Massenverifizierung der analysierten Glykane, was mit LC-basierten Methoden mit einem fluoreszierenden Detektionsausgang oder Lektin-Mikroarrays nicht möglich ist. Bei dieser Methode werden LC- und Fluoreszenzdetektionen verwendet, um Glykanidentitäten mithilfe eines Retentionszeitvergleichs einem Dextranleiterstandard zuzuweisen. Die Fluoreszenzüberwachung ermöglicht eine erhöhte Empfindlichkeit und Quantifizierung aufgrund der einfachen Detektion, bei der MS allein aufgrund der schlechten Ionisationseffizienz von Oligosacchariden möglicherweise nicht in der Lage ist, Arten mit geringer Häufigkeit zu quantifizieren. Die Masseninformationen von MS werden verwendet, um glykanische Identitäten zu bestätigen, aber die Verarbeitungssoftware verwendet keine Masseninformationen als primäre Zuweisungskriterien. Daher kann diese Methode ohne reproduzierbare Chromatographie und leicht lösbare Spitzen bei Glykan-Zuweisungen leiden. Glücklicherweise kann die Masseninformation bei Glykan-Zuweisungen helfen, selbst in Situationen, in denen die Chromatographie unterdurchschnittlich ist, wie z. B. Verschiebungen der Retentionszeit, die reproduzierbare Glykan-Aufgaben behindern. Wenn diese Methode ohne MS verwendet wird, muss die Chromatographie auf der höchsten Ebene sein, da Masseninformationen nicht verwendet werden können, um die Verweilzeitdrift zu korrigieren.
Die hier beschriebene Aminosäureanalysemethode nutzt LC-MS für die schnelle Quantifizierung unteriatisierter Aminosäuren in Rohzellkulturmedien. Alternative Aminosäureanalysemethoden erfordern Aminosäure-Derivatisierungsmittel, um den UV-Nachweis zu ermöglichen26. Die LC-MS-Methode bietet wichtige Vorteile gegenüber der LC-UV-Methode: Sie ermöglicht die Identifikation sowohl auf Retentionszeit als auch auf Ionenmasse im Gegensatz zur LC-UV-Methode, die durch einen Mangel an Massencharakterisierung begrenzt wird. Darüber hinaus bietet die LC-MS-Methode Zeit- und Reproduzierbarkeitsvorteile, da das LC-UV-Verfahren eine zeitaufwändige Ableitungsreaktion erfordert, die Probenvariabilität27vermitteln kann. Die Injektion von Rohzellkulturmedien in die LC-MS-Methode kann jedoch schädliche Auswirkungen auf das MS-Signal aufgrund von Ionenabschäum-Fouling haben. Eine Kalibrierleiter wird häufig als Systemeignungsprüfung injiziert, und die Stichprobenreihenfolge wird randomisiert, um Verzerrungen in den Daten zu verhindern.
Das Zellkulturverfahren zur Antikörperproduktion mit Mikrobioreaktoren wurde zuvor beschrieben9. In dieser Studie sind detaillierte Protokolle für monoklonale Antikörpercharakterisierungsmethoden, die Daten maximieren, die aus begrenzten Probenvolumina gewonnen wurden, klar definiert. Begrenzte Mengen an geernteter Zellkulturflüssigkeit können manchmal die erfassten Produktinformationen einschränken, und die Auswahl der richtigen Analyseverfahren zur Gewinnung von Produktqualitätsdaten ist unerlässlich. Analysen sind wichtig, um vorgelagerte Prozessparameter mit den Änderungen der Produktqualität zu verknüpfen. Hier wird eine Richtlinie für Den Anwender zur Charakterisierung von mAbs bei der Arbeit mit Mikrobioreaktoren bereitgestellt.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Scott Lute für die analytische Unterstützung, die er geleistet hat. Die teilweise interne Finanzierung und Unterstützung dieser Arbeiten erfolgt durch das CDER Critical Path Program (CA #1-13). Dieses Projekt wird zum Teil durch einen Termin für das Praktikums-/Forschungsbeteiligungsprogramm beim Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education zwischen dem US-Energieministerium und der FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |