여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.
셀 운동은 placental 개발 및 임신 초기 동안 trophoblasts의 중요 한 속성 이다. 적절 한 trophoblast 마이그레이션 및 침략의 중요성 모성 맥 관 구조의 부적당 한 trophoblast 침공과 관련 된 사전 eclampsia 및 자궁내 성장 제한 같은 임신 장애에 의해 증명 됩니다. 불행히도, 메커니즘의 우리의 이해는 태에서 마이그레이션 개발 trophoblasts 제한 됩니다. 스크래치 분석 결과 통해 셀 이동의 생체 외 분석 trophoblast 철새 용량을 조절 하는 요소 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, 혼자이 분석 결과 변경 된 셀 이동에서 발생할 수 있는 세포 변화를 정의 하지 않습니다. 이 프로토콜 설명 trophoblast 셀 운동 평가를 공동으로 사용 되는 세 가지 다른 생체 외 분석 실험: 스크래치 분석 결과, 침공 분석 결과 및 확산 분석 결과. 여기에 설명 된 프로토콜 계량 셀 운동 자극에 대 한 응답에서을 다른 셀 라인에 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 메서드는 셀 운동에 기여 하 고 기본 셀 마이그레이션에 명백한 변경 잠재적인 메커니즘의 철저 한 검사를 제공 하는 개별 요소 식별에 조사 수 있습니다.
Placental 발달은 임신, 산 모와 태아 모두 건강에 영향을 미치는의 설립에 중요 한 단계 이다. 그러나, 기계적으로이 프로세스는 발생 합니다 완전히 이해 하지는. 셀 마이그레이션 임신 중의 태 반 기능과 설립에 기여 하는 중요 한 생물 학적 과정 이다. Blastocyst 주입, 다음은 trophectoderm villous trophoblasts 융 villi의 표면을 커버 하 고 가스 및 영양소 교환에 관련 된, 그리고는 villi에서 마이그레이션할 extravillous trophoblasts (EVTs)으로 차별화 그리고 침략 모성 decidua 및 맥 관 구조1. EVTs의 마이그레이션 모성 나선형 동맥을 개장 하 고 태아 성장2를 지 원하는 uteroplacental 순환 설정에 대 한 필수적입니다. 임신 중 부족 trophoblast 침공 비정상적인 태 반 개발 결과 자간 전 증, 임 신성 고혈압, 자 궁 내 성장 제한, 조산3, 등 임신 합병증에 기여할 수 있습니다. 4. 따라서, trophoblast 운동에 영향을 주는 요소를 이해 정상적인 placentation에 필요한 경로 결정 하는 것이 필수적입니다.
Trophoblast 마이그레이션 신호 분자, 성장 인자, cytokines, 호르몬, 신생 요인5등의 복잡 한 네트워크에 의해 제어 됩니다. Vivo에서 태 반 연구의 제한으로 인해 활용 생체 외 분석 실험 불후 인간의 trophoblast 셀 라인 trophoblast 운동에 기여 하는 요소를 식별 하는 중요 한 되었습니다. 스크래치 및 침입 분석 양적 trophoblast 셀 마이그레이션6,,78에 개별 분자의 역할을 평가 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 어떻게 변화 마이그레이션에 의해 발생할 수 있습니다 변경 셀 침입에 조사에 유용한,이 두 개의 분석 셀 마이그레이션 변경 된 요금에 기여할 수 있는 추가적인 메커니즘에 대 한 계정을 하지 않습니다. 예를 들어 마이그레이션할 수 적은 세포 세포 확산의 속도를 감소 발생할 수 있습니다.
여기, trophoblast 마이그레이션 스크래치, 세포 증식, 세포 침입 분석 실험을 사용 하 여 평가 하기 위한 정량 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 스크래치 분석 결과에서 균일 한 상처 셀 단층에서 만들어지고 격차를 채우기 위해 셀의 마이그레이션 자동화, 시간 경과 상처 크기의 영상과 상처 내의 세포의 조밀도 의해 측정 된다. 셀 확산 분석 결과 셀의 알려진된 시작 수량에 비해 각 시간 지점에서 세포의 비율을 계산 기준으로 합니다. 셀 침공 분석 결과, 세포는 세포 외 매트릭스 코팅 셀 문화 삽입 챔버 (예: Transwell), 위에 시드 그리고 항 암 치료-유인에 기질을 통해 침입 하는 셀의 수 계산 됩니다.
스크래치 분석 결과 어떻게 다른 환경 조건을 결정 하는 데 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 도구 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 것 이다. 침공과 확산 분석 실험 이후에 세포 확산과 침입 셀 마이그레이션에 전반적인 변화에의 기여를 확인 하려면 사용할 수 있습니다. 샨 다, 이러한 분석 셀 운동에 기여할 수 있는 생물 학적 프로세스의 강력한 측정을 제공 합니다. 2 개의 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 라인 HTR-8/SVneo9,10, Swan.71 (Sw.71) 기술된 분석에서 사용 되었다. 그러나, 이러한 분석 셀 이동과 침략의 주요 변조기를 식별 하기 위해 다른 셀 형식에 사용 하기 위해 최적화 또한 수 있습니다.
이 절차는 마이그레이션 및 침략의 사용 trophoblast 셀 운동 측정된 차이에 잠재적인 참가자로 셀 확산의 속도 포함 분석 실험 바탕. 함께 사용이 생체 외 분석 실험은 trophoblast 마이그레이션 조절 세포 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 방법입니다. 위에서 설명한 대로 호르몬, cytokines, 성장 인자, 또는 다른 분자 trophoblast 운동에 미치는 영향을 확인 하려면 trophoblast 세포를 치…
The authors have nothing to disclose.
저자 박사 길 Mor Sw.71 세포를 제공 감사 합니다. 이 연구는 남서에 앨버트 McKern 학자 포상에 의해 지원 되었다
0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |