In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen
Summary
Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.
Abstract
Cel verkeer is een essentiële eigenschap van trophoblasts tijdens de ontwikkeling van de placenta en vroege zwangerschap. Het belang van goede trofoblast migratie en invasie wordt aangetoond door zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie en uteriene groei beperking, die verband houden met ontoereikende trofoblast invasie van de maternale therapieën. Helaas, onze inzicht in de mechanismen die de placenta ontwikkelt zich uit het migreren trophoblasts is beperkt. In vitro analyse van cel migratie via de kras assay is een nuttig hulpmiddel bij het identificeren van factoren die trofoblast trekkende capaciteit regelen. Deze bepaling alleen geeft echter geen definitie van de cellulaire veranderingen die leiden een gewijzigde cel migratie tot kunnen. Dit protocol beschrijft drie verschillende in-vitrotests die gezamenlijk worden gebruikt voor het evalueren van de trofoblast cel verkeer: de kras assay, de bepaling van de invasie en de bepaling van de proliferatie. De protocollen die hier beschreven kunnen ook worden aangepast voor gebruik in andere cellijnen te kwantificeren van cel mutatie in reactie op stimuli. Deze methoden kunnen onderzoekers individuele factoren die bijdragen tot de beweging van de cel en zorgen voor een grondig onderzoek van mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de schijnbare wijzigingen in cel migratie te identificeren.
Introduction
Placenta ontwikkeling is een cruciale stap in de inrichting van de zwangerschap, zowel in moederlijke en foetale gezondheid beïnvloeden. De mechanistische basis waarmee dit gebeurt is echter niet volledig begrepen. Cel migratie is een belangrijke biologisch proces dat aan de totstandkoming en de functies van de placenta tijdens de zwangerschap bijdraagt. Na de implantatie van de blastocyst onderscheidt de trophectoderm in villous trophoblasts, die betrekking hebben op het oppervlak van de verdikte villi en zijn betrokken bij gas en nutriënten uitwisseling, en extravillous trophoblasts (EVTs), die migreren uit van de villi en de moeders decidua en therapieën1binnen te dringen. Migratie van de EVTs is essentieel voor het remodelleren van maternale spiraal slagaders en tot de oprichting van uteroplacental verkeer ter ondersteuning van de foetale groei2. Onvoldoende trofoblast invasie tijdens de zwangerschap leidt tot een abnormale ontwikkeling van de placenta en kan bijdragen aan zwangerschapscomplicaties zoals gestational hypertensie, pre-eclampsie, intra-uteriene groei beperking en vroeggeboorte3, 4. Inzicht in de factoren die invloed hebben op de beweeglijkheid van de trofoblast is daarom essentieel om het bepalen van de trajecten die nodig zijn voor normale placentation.
Trofoblast migratie wordt gecontroleerd door een complex netwerk van signalering van moleculen, met inbegrip van groeifactoren, cytokines, hormonen en angiogenic factoren5. Als gevolg van de beperkingen van het bestuderen van de placenta in vivo, vereeuwigd in-vitrotests gebruik te maken van menselijke trofoblast cel lijnen cruciaal zijn voor het identificeren van de factoren die aan de beweeglijkheid van de trofoblast bijdragen. Kras en invasie testen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van individuele moleculen trofoblast cel migratie6,7,en8kwantitatief te evalueren. Echter, terwijl nuttig om te onderzoeken hoe veranderingen in migratie kunnen worden veroorzaakt door wijzigingen in cel invasiviteit parallel, deze twee testen geen rekening met aanvullende mechanismen die aan de gewijzigde tarieven van cel migratie bijdragen kunnen. Verlagingen van het tarief van celproliferatie kunnen bijvoorbeeld resulteren in minder cellen beschikbaar zijn om te migreren.
Hier beschrijven we kwantitatieve in-vitro methoden voor de beoordeling van de trofoblast migratie met behulp van kras, celproliferatie, en cel invasie testen. In de scratch assay, een uniforme wond wordt gemaakt in een cel enkelgelaagde en de migratie van de cellen om het gat te vullen wordt gemeten door geautomatiseerde, time-lapse beeldvorming van de grootte van de wond en dichtheid van de cellen binnen de wond. De cel proliferatie bepaling is gebaseerd op de berekening van de verhouding tussen cellen op elk punt van de tijd in vergelijking met een bekende startende hoeveelheid cellen. In de cel invasie assay, cellen worden overgeënt bovenop een extracellulaire matrix beklede cel cultuur invoegen kamer (bijvoorbeeld Transwell) en het aantal cellen die via de extracellulaire matrix in reactie op de chemo-lokstof binnenvallen worden geteld.
De kras assay is een eenvoudige en effectieve tool die kan worden gebruikt om te bepalen hoe de verschillende omgevingsfactoren invloed op cel migratie. De proliferatie en invasie testen kunnen vervolgens worden gebruikt om te bepalen van de bijdrage van celproliferatie en invasiviteit aan algemene veranderingen in cel migratie. Gezamenlijk bieden deze gehaltebepalingen robuuste metingen van biologische processen die tot de beweeglijkheid van de cel bijdragen kunnen. Twee vereeuwigd eerste-trimester trofoblast-cellijnen werden gebruikt in de beschreven tests, de Swan.71 (Sw.71) en de HTR-8/SVneo9,10. Deze tests kunnen echter ook worden geoptimaliseerd voor gebruik in andere celtypen te identificeren van de belangrijkste modulatoren van cel migratie en invasie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze procedure is gebaseerd op het gebruik van migratie en invasie testen als u wilt opnemen van het tarief van celproliferatie als een potentiële bijdrage aan gemeten verschillen in trofoblast cel beweging. Samen gebruikt, zijn deze in-vitrotests eenvoudige en effectieve methoden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de cellulaire routes die trofoblast migratie regelen. Zoals hierboven beschreven, kunnen cellen van de trofoblast worden behandeld met hormonen, cytokinen, groeifactoren of andere moleculen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr Gil Mor voor het verstrekken van de Sw.71 cellen. Dit onderzoek werd gesteund door een Albert McKern Scholar Award naar S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
