Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Comunicación entre las neuronas sucede en sitios especializados de contacto denominados sinapsis. Las sinapsis contienen un gran número de proteínas diferentes que orquestar la transmisión sináptica. Algunas de estas proteínas muestran una distribución heterogénea en todo el sistema nervioso y no están presentes en cada sinapsis¹. Un ejemplo de tal proteína es Munc13, que participa en el proceso de cebado de vesículas sinápticas. Existen diferentes isoformas de Munc13, que están distribuidos heterogéneamente en el cerebro², y la presencia o ausencia de isoformas específicas puede influir en la plasticidad sináptica a corto plazo y vesícula sináptica dinámica^{3, 4 , 5}. por lo tanto, es de vital importancia para poder identificar la presencia de diferentes proteínas sinápticas entre áreas del cerebro.

Los métodos de elección para la cuantificación de proteínas sinápticas – hasta ahora – son la espectrometría de masas y de Western Blot, en lugar de inmunohistoquímica^6,7,8,9. En algunos casos, se utilizan varios métodos que se complementan entre sí para evaluar la cantidad y la localización de proteínas específicas (es decir, Wilhelm et al. ¹⁰). el método se describe aquí permite la localización y cuantificación de proteínas de interés sin la necesidad de utilizar cualquier método bioquímico, simplemente empleando los stainings inmunofluorescentes. Otra ventaja aquí es que la cuantificación puede realizarse sobre áreas mucho más pequeñas y, por lo tanto, más específicos, que el logrado por otros métodos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una proteína de referencia confiable es necesario para evaluar la distribución de la proteína de interés.

Fluorescente de tinción por inmunohistoquímica permite identificar rutinariamente la localización de proteínas entre las áreas del cerebro, así como dentro de diferentes compartimientos neuronales. Para identificar los diferentes compartimentos, se utilizan marcadores específicos. Por lo general, los anticuerpos contra la sinapsina y synaptophysin¹¹ pueden utilizarse para etiqueta de vesículas sinápticas, mientras que la zona activa de un terminal presináptico¹²la etiqueta anticuerpos contra fagot. Transportadores vesiculares, como los transportadores vesiculares de glutamato (vGluT) o el transportador vesicular de GABA (vGAT), se utilizan para etiquetar excitatorios¹³ e inhibitorio¹⁴ terminales presinápticos, respectivamente. En el lado postsináptico, anticuerpos contra la proteína Homer pueden ser empleados para marcar las terminales postsinápticas y anticuerpos contra densidad postsynaptic proteínas 95 (PSD95)^15,16,17 o gephyrin^{18 , 19 , 20} puede etiquetar terminales postsinápticos excitatorios o inhibitorios, respectivamente. Mediante el uso de anticuerpos contra una proteína de interés y marcadores tales como los descritos anteriormente, uno puede determinar la localización de dicha proteína. Muchos estudios hasta la fecha han hecho esto en una forma cualitativa²¹. Sin embargo, determinar confiablemente la distribución diferencial de una proteína sináptica específica, uno debe no sólo determinar su presencia o ausencia sino también su concentración relativa. La heterogeneidad de tamaños y densidad de las sinapsis, es importante establecer una relación entre el marcador sináptico y la proteína de interés. De lo contrario, muestra una alta densidad de proteínas sinápticas, solamente debido a la mayor densidad de sinapsis pero no debido a una fuerte presencia de esa proteína en regiones ricas en sinapsis como las capas no piramidal del hipocampo y la capa molecular del cerebelo cada sinapsis (por ejemplo, Wallrafen y Dresbach¹). Por otro lado, las proteínas en el soma neuronal (p. ej., TGN38²²) generalmente presentan fuerte presencia en la capa de células piramidales hipocampales o capa de células de hipocampo o cerebelosas del gránulo debido a la alta concentración de cuerpos celulares neuronales en esas áreas. Por lo tanto, esta distribución no homogénea de las estructuras, en este caso sinapsis, puede conducir a una falsa estimación de la distribución de la proteína del interés propio. Además, hay una variabilidad intrínseca en la tinción de intensidades a través de muestras en los stainings de immunohistochemical. El protocolo descrito aquí tiene esto en cuenta y evita tales sesgos, así como otras advertencias que surgen de métodos inmunohistoquímicos.

En nuestro reciente estudio, hemos utilizado este método para describir la expresión diferencial del motor (también denominado TPRGL²³ SVAP30²⁴) a través de 16 cerebro diferentes zonas¹. Es una proteína sináptica específica de vertebrados que puede encontrarse en asociación a las vesículas sinápticas e influye neurotransmisor lanzamiento^25,26,27. Hemos relacionado la expresión de Mover a la abundancia de vesículas sinápticas, de coloración para el synaptophysin como un marcador de referencia de la vesícula sináptica. Se encontraron altos niveles del motor particularmente en la amígdala, los núcleos septales y el pallidum ventral. En el hipocampo, encontramos una distribución heterogénea de Mover, con altos niveles en las capas asociadas con cómputo intra-hippocampal y bajos niveles en las capas de entrada y salida.