Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Comunicação entre os neurônios acontece em sites especializados de contato chamados sinapses. Sinapses contêm uma miríade de diferentes proteínas que orquestrar a transmissão sináptica. Algumas dessas proteínas mostram uma distribuição heterogênea em todo o sistema nervoso e não estão presentes em cada sinapse¹. Um exemplo de tal uma proteína é Munc13, que está envolvida no processo de preparação das vesículas sinápticas. Existem diferentes isoformas de Munc13, que são distribuídas de forma heterogénea ao longo do cérebro², e a presença ou ausência de isoformas específicas pode influenciar a curto prazo plasticidade sináptica e vesícula sináptica dinâmica^{3, 4 , 5}. portanto, é de vital importância para ser capaz de identificar a presença de diferentes proteínas sinápticas em todas as áreas do cérebro.

Os métodos de escolha para quantificação de proteínas sinápticas – até agora – são espectrometria de massa e mancha ocidental, ao invés de immunohistochemistry^6,7,8,9. Em alguns casos, vários métodos são usados para se complementam para avaliar tanto a quantidade e a localização de proteínas específicas (ou seja, Wilhelm et al . ¹⁰). o método descrevemos aqui permite a localização e quantificação de proteínas de interesse sem a necessidade de usar qualquer método bioquímico, simplesmente empregando colorações de imunofluorescência. Outra vantagem aqui é que a quantificação pode ser feita sobre áreas muito menores e, portanto, mais específicos, do que aqueles obtidos por outros métodos. No entanto, é preciso levar em consideração que uma proteína de referência confiável é necessária para avaliar a distribuição da proteína de interesse.

Coloração fluorescente por imuno-histoquímica permite identificar rotineiramente a localização de proteínas em todas as áreas do cérebro, bem como no âmbito de diferentes compartimentos neuronais. Para identificar os diferentes compartimentos, marcadores específicos são utilizados. Normalmente, os anticorpos contra synapsin e Sinaptofisina¹¹ podem ser usados para rotular vesículas sinápticas, enquanto anticorpos contra Fagote rotular a zona ativa de um terminal pré-sináptica¹². Os transportadores vesiculares, tais como os transportadores de glutamato vesicular (vGluT) ou transportador vesicular de GABA (vGAT), são usados para rotular excitatórios¹³ e inibitórios¹⁴ terminais pré-sináptica, respectivamente. No lado pós-sináptica, anticorpos contra a proteína de Homer podem ser empregados para marcar terminais pós-sinápticos e anticorpos contra a densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95)^15,16,17 ou gephyrin^{18 , 19 , 20} pode rotular terminais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios, respectivamente. Usando anticorpos contra uma proteína de interesse e marcadores tais como as descritas acima, pode-se determinar a localização de tais proteínas. Muitos estudos até à data este feito em uma maneira qualitativa²¹. No entanto, para determinar a distribuição diferencial de uma proteína sináptica específica de forma fiável, um deve não somente determinar sua presença ou ausência, mas também sua concentração relativa. A heterogeneidade de tamanhos e densidade de sinapses tornam importante estabelecer uma relação entre o marcador sináptico e a proteína de interesse. Caso contrário, regiões de sinapse-ricos tais como as camadas não-piramidais do hipocampo e a camada molecular do cerebelo mostrará uma alta densidade de proteínas sinápticas, apenas devido à maior densidade de sinapses, mas não devido a uma forte presença de proteínas na cada sinapse (por exemplo, Wallrafen e Dresbach¹). Por outro lado, as proteínas no soma neuronal (por exemplo, TGN38²²) mostrará geralmente forte presença na célula piramidal hippocampal camada ou camada de célula grânulo hippocampal ou cerebelar devido a alta concentração de corpos de células nessas áreas. Portanto, esta distribuição não homogênea de estruturas, neste caso as sinapses, pode levar a uma falsa estimativa da distribuição da proteína de interesse em si. Além disso, há uma variabilidade intrínseca as intensidades de coloração através de amostras em colorações imuno-histoquímica. O protocolo descrito aqui leva isso em consideração e evita tais preconceitos, bem como outras limitações que surgem a partir de métodos de imuno-histoquímica.

Em nosso recente estudo, nós usamos este método para descrever a expressão diferencial de motor (também chamado de TPRGL²³ ou SVAP30²⁴) através de de áreas cerebrais diferentes 16¹. Motor é uma proteína sináptica vertebrado-específicos que pode ser encontrada em associação com vesículas sinápticas e influencia a liberação de neurotransmissor^25,26,27. Podemos ter relacionado a expressão de Mover para a abundância das vesículas sinápticas, manchando para Sinaptofisina como um marcador de referência de vesícula sináptica. Encontramos altos níveis de motor particularmente em núcleos septais, o pallidum ventral e a amígdala. Dentro do hipocampo, encontramos uma distribuição heterogênea de motor, com altos níveis nas camadas associadas a computação intra-hipocampo e níveis baixos em camadas de entrada e saída.