준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

줄기 세포 유전자 치료 인간 병 리의 넓은 범위를 해결 하는 강력한 수단 이다. HSPC 유전자 치료는 특히 매력적인 접근 이다, i) 상대적으로 완화의 환자에서 이러한 셀을 수집 ii) 사용할 수 셀 표면 고기 및 ex vivo 문화 매개 변수 이며, 필드와 확장, 지식 재산 때문 때문에 iii) 과학자 들은 유전자 수정 전략 관심의 다양 한 질병에 맞게 늘어나는 도구 상자와 함께 제공. 우리는 적극적으로 HSPC 생물학, 유전자 수정 HSPCs 전 임상 생체 조건 모델에서의 engraftment 및 관련 환자 인구를 응용 프로그램의 기초 과학을 포함 하 여 여러 각도에서 HSPC 유전자 치료 접근을 조사 하고있다. 우리와 다른 기능적으로 뚜렷한 HSPC 하위 집합^1,2,3, 동원 및 컨디셔닝 regimens HSPC 수율 및 최소화 하면서 engraftment를 극대화 하는 세포 표면 표현 형 특징 있다 독성^4,5, 그리고 유전자 수정 및 다양 한 악성, 유전, 그리고 전염병^6,7,8,^{를 맞게 되었습니다 유전자 편집 전략 9,10}. 쥐, 개, NHPs를 포함 한 작은 큰-동물 모델의 여러에서 기능과 유전자 수정 HSPCs의 engraftment를 평가할 수 있습니다. 특히, NHP 모델은 많은 시 약, 예를 들어 CD34 CD90, 같은 HSPC 세포 표면 단백질을 위한 특정 항 체를 번갈아 인간과 NHP 셀에 사용할 수 있기 때문에 유리. 또한, 마우스, 달리 NHPs 같은 큰 동물 허용 가까이 근사 유전자 수정의 규모의 임상 효능에 필요한. 마지막으로, NHPs 에이즈-1 감염¹¹ 같은 인간의 병 리 모델링에 대 한 황금 표준 고 후보 항 암 및 항 HIV immunotherapies^12,13신흥 모델 시스템입니다.

이 프로토콜의 목적은 NHP HSPC 주입 제품 준비 및 정화, 유전자 수정 방법 개요입니다. 이 프로토콜의 범위 밖에 서 우리는 이전에 표시 있지만 이러한 제품 헌 NHP 호스트에서 engraft 모든 조 혈 계보, 하 고 질병 모델¹의 광범위 한 범위에서 치료 효능을 제공 합니다. 우리 또한 engrafting HSPCs의 clonality를 특징 하 고 속도 론, 매매, 및 개별 HSPCs 및 그들의 자손, 다음 헌 이식^1,14형 추적 플랫폼을 구축. 여기에 제시 된 방법은 다음과 같은 목표와 함께 개발 되었습니다: i)를 매우 순수한 HSPCs 장기 engrafting HSC 하위 집합, ii) 게 유지와 ex vivo 문화, 동안 원시 HSCs iii)를 효율적으로 유전자-수정 중 대량 HSPCs 격리 또는 장기 HSC 하위 집합 engrafting 형광 활성화 된 세포 (FACS), 격리 phenotypically/기능적으로 뚜렷한 HSPC 인구, 많은 그룹^{2,15의 방법으로 일관 된 정렬 뿐만 아니라 자기 기반 셀 정렬 (맥)을 고용 16}. 문화에 기본 HSCs의 유지 보수 (즉, 림프 및 골수성 하위 집합을 분화 완전 하 일으키 다하고 창시자로이 세포의 분화를 최소화) 여기에 설명 된 프로토콜의 필수적인 일 면 이다. 비록 우리는 원시적인 형^17,18, 여기, 유지 하면서 HSPCs를 확장 하는 접근을 특징 이전는 최소한의 (48 h) 통해 HSCs를 유지에 초점을 맞추고와 ex vivo 문화 정의 하는 프로토콜을 설명 합니다.

HSPCs 및 HSC의 효율적인 수정 하위 집합이이 프로토콜의 중앙 목표 이다. 몇 가지 방법을 우리는 보고, 중 2 개는 지금까지 가장 조사에서 임상 시험: LV 중재 유전자 수정 및 편집^1,,619nuclease 중재 하는 유전자. 유전자 편집 전략 특히 관심의 대상된 유전자 수정 nuclease 플랫폼의 수 중 하나를 사용, 예를 들어 C C chemokine 수용 체 타입-5 (CCR5) 치료에 대 한 HIV 감염^7,19 또는 Bcl11A의 치료에 대 한 hemoglobinopathies⁶의. 여기, 우리는 유전자 변형 화물 통합 semirandomly 게놈^1,,820LV 중재 유전자 수정에 집중 한다. LV 방식의 주요 장점은 (최대 8 또는 9 kilobases) 유전 물질의 대용량을 제공 하는 능력입니다. 유전자 편집 전략 transgene 지정 된 장소에만 통합 하는 관심의 대상으로 동종 기증자 재결합 (HDR)에 의해 개발 되고있다, 하지만 이러한 방법을 더 생체 외에서 그리고 작은 동물 모델 개발이 필요 합니다. 대조적으로, LV 벡터 사용 되었습니다 광범위 하 게 NHPs와 환자^21,22. 중요 한 것은, 사용 하는 시작 HSPC 소스로 BM 액, 여기에 설명 된 프로토콜 적응 수 있다 수 쉽고 광범위 하 게, 예를 들어 PBSCs을. 위에서 설명한 대로 우리 두 종에 적용 되는 시 약을 사용 하 여 NHPs와 인간 사이의 유전적 유사성의 높은 학위의 활용. 마지막으로,이 이렇게 맞게 조정 되었습니다 다른 조 혈 하위 집합, 즉 T 세포^12,,2324; 수정 하 효과 T 세포 immunotherapy 접근의 출현이이 프로토콜에서 동일한 LV 플랫폼 무 겁 게 의존 하고있다. 이러한 메서드는 모든 연구원 HSPC 생물학 또는 LV 중재 유전자 수정에 적합 합니다. 여기에 제시 된 HSPC 정화 프로토콜 소설 HSC 농축 하위 집합의 특성을 사용 하는 수 예를 들어 앞에서 설명한^1,,1525. 마찬가지로, 여기에 제시 하는 방법 수 마찬가지로 LV 변환 적용 되며 다른 수많은 세포 유형 및 실험적인 질문, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에 대 한 개발.

요약 하자면, 우리는 분리 및 유전자 NHP HSPCs를 수정 하는 방법을 제시. 이러한 메서드는 다른 종 및 HSPCs의 다른 소스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 철저 하 게 검증 된 프로토콜 수많은 인간의 질병에 대 한 효과가 치료의 모델링에 큰 약속을 보여줍니다.