In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen
Summary
Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, wij brengen verslag een in vitro B-cel plasma cel differentiatie model.
Abstract
Plasmacellen (PCs) grote hoeveelheid antilichamen afscheiden en ontwikkelen van B-cellen die zijn geactiveerd. PC’s zijn van zeldzame cellen zich in het beenmerg of de mucosa en zorgen Humorale immuniteit. Vanwege hun lage frequentie en de locatie, de studie van PC’s is moeilijk in de mens. We gemeld een B naar PC in-vitro differentiatie model met behulp van geselecteerde combinaties van cytokinen en activering moleculen die toestaan om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt in vivo. In deze in vitro model geheugen B cellen (MBCs) zal onderscheiden in pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), vroeg PC’s en ten slotte in langlevende Kortbij PC’s, met een fenotype hun tegenhangers in gezonde individuen. Ook bouwden we een open toegang bioinformatica tools voor het analyseren van de meest prominente informatie van GEP gegevens met betrekking tot differentiatie van de PC. Deze middelen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de menselijke B PC differentiatie en in de huidige studie, we onderzocht de expressie genregulatie epigenetische factoren tijdens menselijke B naar PC differentiatie.
Introduction
De differentiatie van B-cellen tot plasmacellen (PCs) is essentieel voor de Humorale immuniteit en beschermen van de host tegen infecties1. B bij PC differentiatie wordt geassocieerd met grote veranderingen in de transcriptie capaciteit en metabolisme geschikt voor tot antilichaam secretie. De transcriptiefactoren waarmee B naar PC differentiatie zijn uitvoerig bestudeerd en geopenbaarde exclusieve netwerken met inbegrip van B – en PC-specifieke transcriptie factoren (TFs)2. In de B-cellen zijn PAX5, BCL6 en BACH2 TFs de hoeders van de B-cel identiteit2,3. Inductie van IRF4, PRDM1 BLIMP1 en XBP1 PC TF-codering zal uitdoven van B-cel genen en veroorzaken een gecoördineerde antilichaam-afscheidende cellen transcriptionele programma3,4,5. Deze gecoördineerde transcriptionele veranderingen worden geassocieerd met de activering van de transcriptie van Ig genen samen met een verschuiving van de membraan-gebonden vorm naar de secreted vorm van de immunoglobuline zware ketting2,3, 4. B bij de differentiatie van de PC is verbonden met inductie van genen betrokken bij endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat functioneert gelijktijdige met ongevouwen eiwitten reactie (UPR) activering bekend dat spelen een sleutelrol in de PC door tegemoet te komen aan de synthese van uitgescheiden immunoglobulinen6,7. De TF-XBP1 speelt een belangrijke rol in deze cellulaire aanpassing8,9,10.
B-cellen en PC’s zijn de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit. Inzicht in de biologische processen die controle de productie en het voortbestaan van normale plasmacellen is cruciaal in therapeutische interventies die moeten zorgen voor efficiënte immuunrespons en autoimmuniteit of immuun-deficiëntie te voorkomen. PC zijn zeldzame cellen met vroege stadia van de differentiatie plaatsvindt in anatomische locaties die volledige biologische karakterisering, met name in de mens belemmeren. Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, hebben we een in vitro B gemeld aan PC differentiatie model. Dit model reproduceert de sequentiële celdifferentiatie en rijping die zich voordoen in de verschillende organen in vivo11,12,13. In een eerste stap, geheugencellen B zijn voor het eerst activeerde voor vier dagen door de combinatie van interactie CD40-ligand, oligodeoxynucleotides en cytokine en onderscheid maken in preplasmablasts (PrePBs). In een tweede stap, preplasmablasts om te differentiëren in plasmablasts (PBs) veroorzaakt door het verwijderen van CD40L en oligodeoxynucleotides stimulatie en de combinatie van cytokine te wijzigen. In een derde stap, worden plasmablasts veroorzaakt om te differentiëren in vroege PC’s door het veranderen van de cytokine combinatie11,12. Een vierde stap werd geïntroduceerd om volledig volwassen PC’s door het kweken van deze vroege PC’s met beenmerg stromale cellen geconditioneerd medium of geselecteerde groeifactoren13. Deze volwassen PC’s kunnen enkele maanden in vitro overleven en afscheiden van hoge bedragen van immunoglobuline (Figuur 1). Interessant is dat recapituleert ons in vitro model de gecoördineerde transcriptionele veranderingen en het fenotype van de verschillende stadia van de PC die gevonden in vivo11,12,13,14 worden kan B ,15. PC’s zijn zeldzame cellen en onze in-vitro differentiatie-model maakt het mogelijk om de studie van de menselijke B naar PC differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de mens zijn PC zeldzame cellen met differentiatie etappes plaatsvinden in anatomische plaatsen die volledige biologische karakterisering in de weg staan. We hebben ontwikkeld, een in vitro B PC differentiatie model met behulp van scriptingregel cultuur systemen waar verschillende combinaties van moleculen van activering en cytokines worden vervolgens toegepast om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt de verschillende organen/weefsels in vivo11,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Franse INCA (Institut National du Cancer) Instituut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) en ITMO kanker (MM & TT).
Materials
| anti-CD2 magnetic beads | Invitrogen | 11159D | |
| Anti-CD138-APC | Beckman-Coulter | B49219 | |
| Anti-CD19-APC | BD | 555415 | |
| Anti-CD20-PB | Beckman-Coulter | B49208 | |
| Anti-CD27-PE | BD | 555441 | |
| Anti-CD38-PE | Beckman-Coulter | A07779 | |
| Anti-histidine | R&D Systems | MAB050 | |
| CpG ODN(PT) | Sigma | T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T |
|
| human Transferin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| IFN-α | Merck | Intron A | |
| IMDM | Gibco | 31980-022 | |
| Recombinan Human CD40L-hi | R&D Systems | 2706-CL | |
| Recombinant Human APRIL | R&D Systems | 5860-AP-010 | |
| Recombinant Human IL-10 | R&D Systems | 217-IL- | |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15-10ug | |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL- | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 |
References
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).
- Shaffer, A. L., et al. Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program. Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).
- Minnich, M., et al. Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation. Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).
- Klein, U., et al. Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination. Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).
- Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response. Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).
- Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Shaffer, A. L., et al. XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation. Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).
- Reimold, A. M., et al. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).
- Jourdan, M., et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).
- Jourdan, M., et al. An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization. Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).
- Jourdan, M., et al. IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors. Leukemia. , (2014).
- Kassambara, A., et al. Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell. Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).
- Kassambara, A., et al. GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells. PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077 (2015).
- Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. Cancer genetics of epigenetic genes. Human Molecular Genetics. 16, 28-49 (2007).
- Pei, H., et al. The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination. Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).
- Le Gallou, S., et al. IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling. Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).
- Cocco, M., et al. In vitro generation of long-lived human plasma cells. Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).
- Leung-Hagesteijn, C., et al. Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).
- Orlowski, R. Z. Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma. Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).
- Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells. Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation. Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).
- Tsai, C. M., et al. Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation. Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).
- Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response. Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).
- Belnoue, E., et al. APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells. Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).
- Huard, B., et al. APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa. Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).
- Ame-Thomas, P., et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 109 (2), 693-702 (2007).
- Ramachandrareddy, H., et al. BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).
- Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).
- McManus, S., et al. The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells. The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).
- Ahmadnejad, M., et al. Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs. Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).
- Beguelin, W., et al. EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation. Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).
- Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies. Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).
- Beguelin, W., et al. EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop. Nature Communications. 8 (1), 877 (2017).
- Herviou, L., et al. PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs. Clinical Epigenetics. 10 (1), 121 (2018).
- Asangani, I. A., et al. Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer. Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).
- Pei, H., et al. MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).
- Cui, J., et al. EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells. Cancer Cell International. 15 (1), 4 (2015).
- Santo, L., et al. Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma. Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).
- Amengual, J. E., et al. Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).
- Schoenhals, M., et al. Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage. Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).
