Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen
Summary
Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats”Myovascular”.
Abstract
Die Endothelzellen der Skelettmuskulatur Kapillaren (Muskel mikrovaskuläre Endothelzellen, MMEC) aufbauen, die Barriere zwischen Blutkreislauf und Skelettmuskulatur regelt den Austausch von Flüssigkeiten und Nährstoffen sowie die Immunantwort gegen Infektionskrankheiten Agenten durch Steuerung der Migration von Immunzellen. Für diese Funktionen MMEC bilden eine funktionelle “Myovascular Gerät” (MVU), mit weiteren Zelltypen, wie Fibroblasten, Perizyten und Skelettmuskelzellen. Infolgedessen trägt eine Dysfunktion der MMEC und damit die MVU zu einer Vielzahl von Myopathien. Jedoch regulatorische Mechanismen der MMEC in Gesundheit und Krankheit bleiben nur unzureichend verstanden und ihre Aufklärung vor spezifische Behandlungen für Myopathien. Die Isolation und die eingehende Untersuchung der primären MMEC Funktionen im Zusammenhang mit dem MVU könnte ein besseres Verständnis dieser Prozesse erleichtern.
Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur primären murinen MMEC des skelettartigen Muskels durch mechanische und enzymatische Dissoziation einschließlich Reinigung und Kultur Wartungsschritte isolieren.
Introduction
Über Blut, Zellen und Organe werden mit Sauerstoff, Substrate und anderen notwendigen Molekülen geliefert. Dieser Austausch findet in Kapillaren, die kleinsten Gefäße. Kapillaren sind durch eine innere Endothelzellen (EG) Schicht gebildet deren Integrität eine Voraussetzung für die erfolgreiche Regulierung von Muskel-Homöostase zwischen intravaskulären und interstitiellen Raum bleibt. Um einen selektiven Übergang von lösliche Faktoren und Zellen eine Monolage durch eng miteinander verbunden und Adherens Kreuzungen 1EG dar. Neben seiner Rolle als Barriere für Nährstoffe und Stoffwechselprodukte EG regulieren die Rekrutierung von Leukozyten bei entzündlichen Prozessen. Entzündung oder Gewebe Schaden führt zu einer Up-Regulierung des Adhäsionsmoleküle auf der EG-Oberfläche und die Produktion von Chemokinen Leukozyten Anlage und Transmigration in der Target-Gewebe- 2zu erleichtern. Infolgedessen sind EG kritisch bei der Regulierung der entzündlichen Prozesse wie die Abwehr von Krankheitserregern oder Reparatur von Gewebe beteiligt.
Eine Dysfunktion der EG ist direkt verbunden mit Kreislauf-Erkrankungen, chronischem Nierenversagen, Venenthrombose Erreger schwere Infektionen. Darüber hinaus werden EG praktisch immer bei organspezifischen Autoimmunität z. B. Diabetes Mellitus oder Multiple Sklerose 3beteiligt. Die Barrierefunktion zwischen Blut und Organe erfolgt daher durch ein abgestimmtes Zusammenspiel verschiedener Zelltypen. In der Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen (MMEC) zusammen mit Muskelzellen, Fibroblasten und Perizyten bilden eine funktionelle Einheit, das “Myovascular Gerät” (MVU). Daher könnte eine Dysfunktion der MVU eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Myopathien spielen. Allerdings fehlt noch ein tieferes Verständnis für diese Regulationsmechanismen und derzeit schließt die Identifikation neuer, dringend benötigte, therapeutische Targets in Myopathien.
Um die komplexen physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen, sind Tiermodelle gebräuchlich. In-vitro- Modelle bieten jedoch den Vorteil, auf das Thema von Interesse zu konzentrieren, indem Sie eine Vielzahl von Störfaktoren ausschließen. Um Prozesse zu untersuchen in-vitro-ist es notwendig, reine und tragfähige Primärzellen zu isolieren. Im Gegensatz zur Zell-Linien ermöglichen Primärzellen von transgenen Tieren isoliert, die Konsequenzen von in-vitro-genetische Modifikationen untersuchen.
Hier wird eine Methode zur primären murinen MMEC isolieren beschrieben durch mechanische und enzymatische Dissoziation, gefolgt von magnetisch aktivierte Zelle sortieren Techniken (MCS) für die Reinigung verwenden. Zu diesem Zweck werden magnetische Beads gegen bestimmte Oberflächenmarker verwendet. Thrombozyten Endothelzellen Adhäsion Molekül-1 (PECAM1, CD31) drückt sich vor allem auf EG und kann verwendet werden, um diesen Zelltyp zu bereichern. Um hohen Reinheit zu gewährleisten, sind Zellen des hämatopoetischen Ursprungs durch eine negative Auslese für Protein-Tyrosin-Phosphatase-Rezeptor-Typ C (PTPRC, CD45) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden Qualitätskontrollen, Anbau von primären murinen MMEC, Anwendungsmöglichkeiten sowie Einschränkungen und Besonderheiten vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrovaskuläre Endothelzellen bieten Barriere Funktionen in allen Geweben und deren Dysfunktion Ergebnisse bei der Krankheit der zugeordneten Organe 3. Organspezifische Untersuchungen der mikrovaskuläre EG könnte darüber hinaus den Weg für neue therapeutische Strategien ebnen. Daher ist ein tieferes Verständnis der mikrovaskuläre EG-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen von großem wissenschaftlichen Interesse. Modulation der Leukozyten/Endothel Interaktion wir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die “Else Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03, TR), “Innovative Medizinische Forschung (IWF) Münster” (I-RU211811, TR) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 und ME 3283/6-1, SGM). Illustrierte Bilder zur Verfügung gestellt von Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
