プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離
Summary
骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular ユニット」の包括的な生体外の調査。
Abstract
(筋微小血管内皮細胞、MMEC) 骨格筋毛細血管の内皮細胞が血流や水分、栄養素、感染に対する免疫応答の交換を規制する骨格筋の間の障壁を構築します。免疫細胞の移動を制御することによってエージェント。これらの関数を MMEC 形成機能「myovascular ユニット」(MVU) さら細胞の種類、線維芽細胞、血管、骨格筋細胞などと。その結果、MMEC したがって、MVU の機能不全は様々 な myopathies に貢献します。しかし、MMEC の健康および病気の制御機構の理解が不十分なまま、その解明 myopathies より特定の処置の前に。分離と、MVU のコンテキストでプライマリ MMEC 関数の詳細な調査は可能性がありますこれらのプロセスのよりよい理解を促進します。
この記事は、浄化と文化保守手順などを含む機械と酵素の解離によって骨格筋のプライマリ マウス MMEC を分離するプロトコルを提供します。
Introduction
酸素、基板、その他の必要な分子血流を介して細胞や臓器を納入します。このインターチェンジは、毛細血管、最小の容器で行われます。毛細血管は、その整合性のまま血管内と間質性スペース間筋恒常性の正常な調節の前提条件内部内皮細胞 (EC) レイヤーによって形成されます。可溶性因子や細胞の選択的な移行を確保するため、EC はタイトで相互接続された単分子膜と単接合1を構成します。栄養素や代謝産物のための障壁としての役割のほか、EC は白血球炎症のプロセスの募集を調節します。炎症や組織の損傷は、EC の表面と白血球の添付ファイルとターゲット組織2に移住を促進するケモカインの製造接着分子のアップレギュレーションにつながります。その結果、EC 批判的に病原体または組織の修復に対する防御など炎症性プロセスの調節に関与しています。
EC の機能不全は直接血管疾患、慢性腎機能障害、静脈血栓症深刻な病原体感染症に関連付けられています。さらに、EC 事実上常に糖尿病や多発性硬化症3など臓器特異免疫に関与しています。血流や臓器間バリア機能したがって、異なる種類の細胞の協調的相互作用によって制御されます。骨格筋血管内皮細胞 (MMEC) 一緒に筋細胞、線維芽細胞と血管形成機能ユニット、「myovascular ユニット」(MVU).したがって、機能不全、MVU は筋疾患の病態に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、これらの機構のより深い理解は依然行方不明、現在 myopathies の新しい、緊急に必要な治療標的の同定を排除します。
複雑な生理学的および病態生理学的メカニズムを調べるためには、動物モデルがよく使用されます。ただし、体外モデルは、さまざまな交絡因子を除外することによって関心の対象に焦点を当てることの利点を提供します。プロセスを調査するには、体外必要だ純粋な実行可能な一次電池を分離します。細胞株と対照をなしてトランスジェニック動物由来初代培養細胞は体外遺伝の修正の結果を調査する有効にします。
ここでは、プライマリ マウス MMEC を分離する方法は、機械と酵素の解離を磁気活性化細胞の浄化のための技術 (MCS) の並べ替え順を使用して説明します。この目的のため特定の表面マーカーに対して磁気ビーズを使用します。血小板内皮細胞接着分子-1 (PECAM1、CD31) EC の発現は、この型のセルを豊かに使用することができます。高い細胞純度を保証するには、造血起源の細胞は (PTPRC, CD45) 型受容体蛋白のチロシン脱燐酸化酵素 C の負の淘汰によって除外されます。さらに、品質管理、栽培プライマリ マウス MMEC、潜在的なアプリケーションの制限事項と注意事項が掲載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小血管内皮細胞は、すべての組織にバリア機能と関連臓器3疾患における機能不全成果を提供します。また、微小血管の EC の器官特定研究は新しい治療戦略の道を開く可能性があります。したがって、生理学的および病態生理学的条件下での微小血管の EC 機能のより深い理解は、偉大な科学的な関心です。白血球/血管内皮細胞の相互作用の変調はナタリズマブ、リンパ球…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品によって、「他 Kröner ・ フレゼニウス財団」を受けました (TR に 2018_A03)、”革新的なこの上海虹橋 (IMF) ミュンスター”(私-RU211811 TR) とドイツ研究振興協会 (DFG、INST 2105/27-1、私 3283/5-1、と私 3283/6-1 SGM に).イラスト画像は、平家 Blum によって提供されます。
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
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