Summary

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats”Myovascular”.

Abstract

Die Endothelzellen der Skelettmuskulatur Kapillaren (Muskel mikrovaskuläre Endothelzellen, MMEC) aufbauen, die Barriere zwischen Blutkreislauf und Skelettmuskulatur regelt den Austausch von Flüssigkeiten und Nährstoffen sowie die Immunantwort gegen Infektionskrankheiten Agenten durch Steuerung der Migration von Immunzellen. Für diese Funktionen MMEC bilden eine funktionelle “Myovascular Gerät” (MVU), mit weiteren Zelltypen, wie Fibroblasten, Perizyten und Skelettmuskelzellen. Infolgedessen trägt eine Dysfunktion der MMEC und damit die MVU zu einer Vielzahl von Myopathien. Jedoch regulatorische Mechanismen der MMEC in Gesundheit und Krankheit bleiben nur unzureichend verstanden und ihre Aufklärung vor spezifische Behandlungen für Myopathien. Die Isolation und die eingehende Untersuchung der primären MMEC Funktionen im Zusammenhang mit dem MVU könnte ein besseres Verständnis dieser Prozesse erleichtern.

Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur primären murinen MMEC des skelettartigen Muskels durch mechanische und enzymatische Dissoziation einschließlich Reinigung und Kultur Wartungsschritte isolieren.

Introduction

Über Blut, Zellen und Organe werden mit Sauerstoff, Substrate und anderen notwendigen Molekülen geliefert. Dieser Austausch findet in Kapillaren, die kleinsten Gefäße. Kapillaren sind durch eine innere Endothelzellen (EG) Schicht gebildet deren Integrität eine Voraussetzung für die erfolgreiche Regulierung von Muskel-Homöostase zwischen intravaskulären und interstitiellen Raum bleibt. Um einen selektiven Übergang von lösliche Faktoren und Zellen eine Monolage durch eng miteinander verbunden und Adherens Kreuzungen 1EG dar. Neben seiner Rolle als Barriere für Nährstoffe und Stoffwechselprodukte EG regulieren die Rekrutierung von Leukozyten bei entzündlichen Prozessen. Entzündung oder Gewebe Schaden führt zu einer Up-Regulierung des Adhäsionsmoleküle auf der EG-Oberfläche und die Produktion von Chemokinen Leukozyten Anlage und Transmigration in der Target-Gewebe- 2zu erleichtern. Infolgedessen sind EG kritisch bei der Regulierung der entzündlichen Prozesse wie die Abwehr von Krankheitserregern oder Reparatur von Gewebe beteiligt.

Eine Dysfunktion der EG ist direkt verbunden mit Kreislauf-Erkrankungen, chronischem Nierenversagen, Venenthrombose Erreger schwere Infektionen. Darüber hinaus werden EG praktisch immer bei organspezifischen Autoimmunität z. B. Diabetes Mellitus oder Multiple Sklerose 3beteiligt. Die Barrierefunktion zwischen Blut und Organe erfolgt daher durch ein abgestimmtes Zusammenspiel verschiedener Zelltypen. In der Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen (MMEC) zusammen mit Muskelzellen, Fibroblasten und Perizyten bilden eine funktionelle Einheit, das “Myovascular Gerät” (MVU). Daher könnte eine Dysfunktion der MVU eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Myopathien spielen. Allerdings fehlt noch ein tieferes Verständnis für diese Regulationsmechanismen und derzeit schließt die Identifikation neuer, dringend benötigte, therapeutische Targets in Myopathien.

Um die komplexen physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen, sind Tiermodelle gebräuchlich. In-vitro- Modelle bieten jedoch den Vorteil, auf das Thema von Interesse zu konzentrieren, indem Sie eine Vielzahl von Störfaktoren ausschließen. Um Prozesse zu untersuchen in-vitro-ist es notwendig, reine und tragfähige Primärzellen zu isolieren. Im Gegensatz zur Zell-Linien ermöglichen Primärzellen von transgenen Tieren isoliert, die Konsequenzen von in-vitro-genetische Modifikationen untersuchen.

Hier wird eine Methode zur primären murinen MMEC isolieren beschrieben durch mechanische und enzymatische Dissoziation, gefolgt von magnetisch aktivierte Zelle sortieren Techniken (MCS) für die Reinigung verwenden. Zu diesem Zweck werden magnetische Beads gegen bestimmte Oberflächenmarker verwendet. Thrombozyten Endothelzellen Adhäsion Molekül-1 (PECAM1, CD31) drückt sich vor allem auf EG und kann verwendet werden, um diesen Zelltyp zu bereichern. Um hohen Reinheit zu gewährleisten, sind Zellen des hämatopoetischen Ursprungs durch eine negative Auslese für Protein-Tyrosin-Phosphatase-Rezeptor-Typ C (PTPRC, CD45) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden Qualitätskontrollen, Anbau von primären murinen MMEC, Anwendungsmöglichkeiten sowie Einschränkungen und Besonderheiten vorgestellt.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von den lokalen Behörden genehmigt und nach dem deutschen Tierschutzgesetz (84-02.05.20.13.097) durchgeführt. 1. Allgemeine Bemerkungen über Tierversuche Gemäß den Richtlinien des jeweiligen institutionellen Tierpflege alle Maus-Experimente durchführen und Ausschuss zu verwenden. Halten Sie Mäuse unter standardisierten Bedingungen und nach internationalen Richtlinien wie der Föderation für Laboratory Animal Science Verbände (FELASA).<s…

Representative Results

Einen Tag nach der Isolation, primären murinen MMEC und Rest andere Zellen bilden Konglomerate und halten an der Unterseite des Kultur-Gerichte (Abbildung 1A Tag 1). Ab Tag 7 können flache und längliche Zellen beobachtet werden. Kontamination von anderen, meist Sphäroid Zellen, ist jedoch nach wie vor sichtbar (Abb. 1A Tag 7). Somit einen weiteren Zyklus CD31 positive Selektion über MCS erforderlich ist. Im folgende…

Discussion

Mikrovaskuläre Endothelzellen bieten Barriere Funktionen in allen Geweben und deren Dysfunktion Ergebnisse bei der Krankheit der zugeordneten Organe 3. Organspezifische Untersuchungen der mikrovaskuläre EG könnte darüber hinaus den Weg für neue therapeutische Strategien ebnen. Daher ist ein tieferes Verständnis der mikrovaskuläre EG-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen von großem wissenschaftlichen Interesse. Modulation der Leukozyten/Endothel Interaktion wir…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die “Else Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03, TR), “Innovative Medizinische Forschung (IWF) Münster” (I-RU211811, TR) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 und ME 3283/6-1, SGM). Illustrierte Bilder zur Verfügung gestellt von Heike Blum.

Materials

0,25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

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Citer Cet Article
Müntefering, T., Michels, A. P., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

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