Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft – Versus – Host-Seuche leiden.
Abstract
Akute Graft – Versus – Host-Seuche (GvHD) stellt die schwersten Komplikation, dass Patienten, die zuvor allogene hämatopoetische Stammzell-Transplantation (allo-HCT) Gesicht und ist häufig mit einem schlechten klinischen Ergebnis verbunden. Weile, zum Beispiel GvHD Manifestationen der Haut sind in der Regel auf etablierten immun-unterdrückende Therapien und, daher nehmen keinen fatalen Kurs, das Vorhandensein und die Intensität der intestinalen GvHD, vor allem von der Mitte zum unteren Teile des Darms, Das Ergebnis stark beeinflussen und insgesamt Überlebenszeit von Patienten mit akuten GvHD. therapeutische Optionen sind im Wesentlichen beschränkt sich auf die klassischen immun-unterdrückende Agenten nur moderate Krankheit mildern Wirkungen nachgeben. Daher detaillierte Kenntnisse über die Gewebe-Resident immun Kaskade, Veränderungen in der intestinalen Mikrobiota, und die stromale Reaktion vor, nach und nach Darm GvHD auftreten sind dringend erforderlich, um die Ereignisse und die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen sein Pathogenese und innovative Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Murine Modelle von GvHD werden häufig eingesetzt zur Feststellung und Beurteilung funktional Moleküle und wegen vermeintlich Darm GvHD fahren. Mittel, insbesondere Überwachung und Evaluierung der Darmentzündung im Laufe der Zeit im Wesentlichen fehlt aber da etablierten Resultate zu bewerten und benoten akuten GvHD routinemäßig verschiedener Parameter bestehen die eher systemische GvHD widerspiegeln Manifestationen. Die detaillierte Auswertung der intestinalen GvHD euthanasierten Mäusen, damit im wesentlichen ausgenommen longitudinale Studien eingeschränkt wurde (z.B. kinetische) Analysen von Kolon Fach unter einem bestimmten Versuchsbedingung (z. B. Antikörper-vermittelten Blockade von einem proinflammatorischen Zytokinen) in live Mäuse (in Vivo). Die Mini-endoskopische in-situ Beurteilung der distalen Dickdarm von allo-HCT-behandelten Mäusen, die hier beschriebenen ermöglicht (a) eine detaillierte makroskopische Auswertung der verschiedenen Aspekte der Darmentzündung und (b) die Möglichkeit, Gewebeproben für nachgelagerte Analysen zu sammeln verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Beobachtungszeitraums. Insgesamt bietet der Mini-endoskopische Ansatz einen großen Fortschritt in präklinischen nichtinvasive Überwachung und Bewertung der intestinalen GvHD.
Introduction
Hämatopoetischen Tumoren entstehen direkt aus dem Fach der hämatopoetischen Stammzellen und unkontrollierte, sind gehen zügig voran und schweren immunvermittelte Erkrankungen oft Indikationen allo-HCT1,2durchführen. Obwohl für das Auftreten der prognostische Vorteil Graft-versus-Tumor Reaktion Buchhaltung, sind Spender-Lymphozyten jedoch häufig induzieren und fördern einen unerwünschten immunvermittelte Angriff von gesundem Gewebe Komponenten innerhalb der allo-HCT-Empfänger , ein Prozess, der Graft – Versus – Host-Seuche3aufgerufen wird. Manifestationen im Darm, der so genannte intestinale GvHD repräsentieren die am meisten gefürchtete Komplikation der akuten GvHD, schwere Formen von denen routinemäßig verbunden mit einer hohen Mortalität1,2,4sind.
Insgesamt, murine Modelle von allo-HCT entstanden als wertvolle Werkzeuge, um zu identifizieren und immunvermittelte Mechanismen der Pathogenese von GvHD5zu studieren. Jedoch kinetische Bestimmung, z. B. wohltuende Wirkung der neue therapeutische Interventionen im Laufe der Zeit im Leben Mäuse routinemäßig basiert auf der Bestimmung der klinischen GvHD punktet6. Während diese Werte entsprechend geeignet sind, zum Beispiel die Krankheit Gesamtbelastung (d. h. die systemische GvHD), klinische punktet fehlen die Empfindlichkeit um zuverlässig Organ-spezifischen Manifestationen spiegeln (z.B., im Darm). Daher fallen Schlussfolgerungen, zum Beispiel in Bezug auf die Darm-protektive Effekte einer bestimmten therapeutischen Intervention, die auf diese scoring-Systeme in der Regel kurz.
Trotz der großen Fortschritte durch die Erfindung von neuartigen Ganzkörper-bildgebende Modalitäten in Kombination mit der Verwendung von entweder Biolumineszenz oder fluoreszierende genetische Maus Modelle7,8, Methoden, direkt und spezifisch Bewerten der intestinalen Manifestation von GvHD in live Mäuse fehlen. Daher ist die Beweggründe für das Protokoll der endoskopischen Beurteilung des intestinalen GvHD Phänotyps im nächsten Abschnitt beschrieben, dieses Hindernis zu überwinden. Darüber hinaus ist die Motivation auch experimentellen Mäuse Zahlen seit, so weit, eine detaillierte Bewertung der zellulären, morphologischen und molekularen Eigenschaften zu reduzieren (z. B., durch Histopathologie oder Molekularbiologie) der Darm GvHD Manifestation ist letztlich das Opfer der experimentellen Maus erforderlich.
Unsere Institution wurde zuvor auf die Methodik einer Mini-endoskopische Beurteilung der Kolon Manifestationen im Zuge Phänomen ulcerosa Modelle9berichtet. In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir weiterentwickelt und angepasst die koloskopischen scoring Matrix für Alloresponse-gesteuerte Kolitis bei live Mäusen mit Darm GvHD nach Transplantation von Alloreactive HCT und Spender-Lymphozyten in einem MHC-Klasse ich vollständig übereinstimmende Einstellung . Wir identifizierten vier Parameter für intestinale GvHD-bezogene Kolon Läsionen widerspiegeln. Darüber hinaus haben wir ein System, das ermöglicht eine fein abgestimmte Verschneidung einzige Determinante, wodurch eine neue Partitur, die leicht den Leser über die Schwere der intestinalen GvHD in einer bestimmten Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden informiert. Histopathologische Untersuchungen bestätigt, dass eine endoskopische Score ab einem bestimmten Schwellenwert Moderate bis hohe Grade Gewebe Entzündungen zuverlässig vorherzusagen ist. Mini-endoskopische Beurteilung scheint daher arbeiten Ersatz für den Goldstandard Histopathologie darstellen, die routinemäßig das Opfer der experimentellen Mäuse erfordert. Wichtig ist, dieses Protokoll kann an nahezu jedem gegebenen Zeitpunkt angewendet werden und kann im Verlauf der Krankheit10,11wiederholt verwendet werden. Außerdem, im Gegensatz zu der Verwendung von Biolumineszenz-abhängige Ansätze, keine Arbeits-intensive und zeitaufwendige Maßnahmen wie kreuzende genetisch Mäuse geändert erforderlich sind und daher kann die Methodik auf praktisch jede Maus Interesse.
Zusammengenommen, in Anbetracht der nachteilige klinischen Perspektive allo-HCT-Patienten mit schweren Darm GvHD, rasanten wissenschaftlichen Fortschritt und einen besseren Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese immun sind dringend notwendig. Ebenso fordern wichtigere, ethische Überlegungen, dass der Erkenntnisgewinn bei der Nutzung der minimalen Anzahl von experimentellen Mäuse erreicht werden soll. Daher erkannt beide, Ansprüche auf die Forschungsgemeinschaft erkunden Darm GvHD vorangebracht werden können, durch die Implementierung von seriellen Mini-endoskopische Auswertungen des Dickdarms in der experimentellen Arbeit Kette zu überwachen und zu benoten Darm GvHD in live experimentelle Maus Modelle, wie beschrieben und im hier vorgestellten Protokoll validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschreibt die Methode der Induktion und Mini-endoskopische Beurteilung des Kolon Phänotyps im Zuge der intestinalen GvHD beobachtet. Es dient breiter ermöglichen Wissenschaftlern, Darm GvHD längs und nicht-invasiv über den gesamten Krankheitsverlauf (z.B. durch das Auftreten von Kolon Manifestation und Verlauf bis maximale Krankheitsaktivität) zu studieren.
Allerdings gibt es einige wichtige Schritte und wichtige Einschränkungen, die die vorgestellten Methoden muss der Exp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch die Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634, Projekt B03) (um K.H) und CRC 1181 (CRC-DFG Projekt B05) (um K.H), beide von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) finanziert.
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
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