Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi
Summary
Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.
Abstract
Bizim bağışıklık sistemi bir numarası ve bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri (Treg) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. Treg hücreler iki alt kümeleri, timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri ve periferik indüklenen Treg (pTreg) hücre bölünmüş olabilir. Vücudumuzun farklı organlarda varsa ve Helios ve Neuropilin 1 gibi özel işaretler tarafından seçkin. Bu tTreg hücreler pTreg hücreleri işlevsel olarak daha baskılayıcı bildirilmiştir. Bu nedenle, türdeş olmayan hücre popülasyonlarının soruşturma ne zaman tTreg ve pTreg hücre oranı belirlemek önemlidir. Burada, biz timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri ve dalağı normoglycemic obez olmayan diyabetik farelerin tTreg hücreleri Akış Sitometresi kullanarak pTreg hücrelerden ayırt etmek için toplanan. El ile tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırladık. Fluorochrome Birleşik yüzey CD4, CD8, CD25 ve Neuropilin 1 antikorlar hücreleri leke için kullanılmıştır. Onlar gece buzdolabında tutuldu. Ertesi gün, hücreleri Birleşik fluorochrome hücre içi Foxp3 ve Helios antikorlar ile lekeli. Bu işaretleri Treg hücreler iki alt kümeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı tek fare timus, dalak ve lenf nodu drene pankreas hücrelerden hazırlamak ve sonraki akış sitometrik çözümlemesi için kullanma a sade ama pratik yol gösterir.
Introduction
Düzenleyici T (Treg) hücreleri bağışıklık sistemi homeostazı için kritik öneme sahiptir. Treg hücreler ifade yüzey antijenleri CD4 ve CD25 ve transkripsiyon faktörü forkhead kutusunu P3 (Foxp3)1,2,3tarafından tanımlanır. Sakaguchi vd. ilk CD25 yapısal T bastırıcı hücrelerde fareler4insan Treg hücreler tanımlaması için öncü bir gözlem sağlanan, ifade edilir gösterdi. Treg hücreler mekanizmaları, Apoptozis, sitokin tüketimi ve inhibisyon sitotoksik ifade yoluyla ikna etmek için granzymes salgısı ile cytolysis dahil olmak üzere çeşitli yoluyla baskılayıcı bir yetenek uygulamakla tarafından bağışıklık hoşgörü merkezi bir rol oynamak T-lenfosit antijeni 45. Ayrıca, dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β), İnterlökin-10 (IL-10) ve IL-355gibi inhibitör sitokinler salgılarlar. Treg hücreler doğal olarak timus bu durumda timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri atanan elde edilebilir veya periferik indüklenen (pTreg) Treg hücreler durumda denir o onlar periferik organlarda bağlı olmak.
Helios, Ikaros transkripsiyon faktörü ailesinin üyesi olan tTreg hücreler arasında ayrım için bir işaret olduğu bildirildi ve pTreg6hücreler. Daha sonra diğer iki grup Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III reseptör tTreg hücreleri belirli koşullar7,8altında yüzey avans olarak hizmet verebilir rapor. Yine de, Singh ve ark. Helios bu bağlamda naif fareler9daha iyi bir işaret olduğunu göstermiştir.
Treg hücreler kümelerine homeostazı bağışıklık sisteminin bakım ve otoimmünite ve enfeksiyona karşı koruma önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, numaraları ve lenfoid ve sigara-lenfoid doku bu nüfus oranlarını belirlemek önemlidir. Bunu başarmak için bir tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırlamak zorunda. Bir dizi Protokolü açıklanan veya önceki çalışmalarda kullanılır. Esas olarak, otomatik dissociators daha önce yayımlanmış raporları10,11‘ kullanılmıştır. Otomatik dissociators kullanmak kullanışlıdır ve zaman tasarrufu, ancak bu pahalı bir işlemdir. Bu nedenle, normoglycemic obez olmayan diyabetik (NOD) fareler ve bu organların izole tek hücreleri tek hücre süspansiyonlar fare timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri (PDLNs) ve dalağı hazırlamak için bir el ile yöntemi kullandık. Bu yöntem bizim önceki çalışmalarda kullanılan ve tek hücre süspansiyon hazırlamak için elle yapılan yöntem otomatik dissociator yöntemi9,12olarak,13,14verimli olduğunu bulduk. Ayrıca, biz Akış Sitometresi CD4 oranlarını belirlemek için kullanılan+CD8–CD25+Foxp3+ Treg hücreler ve Treg kümelerine hücreleri tTreg ve pTreg hücreleri. TTreg ve pTreg hücreleri Helios ve Nrp1 tTreg hücre için işaretleyici olarak kullanarak ayırt edildi. Böylece, bizim sonuçları tek hücreleri hazırlanması için elle yapılan yöntem verimli çalışır ve hazırlanan tek hücre süspansiyonlar daha fazla Akış Sitometresi kullanarak çalışmaları için kullanılabilir gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada izole timik bezleri, PDLNs ve dalağı NOD farelerin tek hücreleri ve Helios ve CD4 Nrp1 ifadesi soruşturma+CD8–CD25+Foxp3+ Treg hücreler Akış Sitometresi kullanarak. Bu da çalışmanın, NOD fareler, hangi tip 1 diyabet fare bir modeldir kullanıldı. Bir önceki çalışmada, biz vahşi türü fare suşları CD-1 ve C57BL/6 fareler Helios veya Nrp1 tTreg hücre pTreg hücrelerden ayırt için daha iyi bir işaret olduğunu araştırmak için kullandık. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu da çalışmanın maddi İsveçli Araştırma Konseyi, EXODIAB, İsveç diyabet Vakfı, İsveçli çocuk diyabet Fonu, SEB Diabetesfonden ve O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca onların destekler ve tartışmalar için teşekkürler Ola başı Carlsson ve Stellan Sandler ister misiniz.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
