الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي
Summary
يصف لنا هنا بروتوكولا للتحقيق في سيتوتوكسيسيتي CD8 مفعّلة+ تي خلايا ضد الخلايا السرطانية عن طريق الكشف عن خلايا السرطان عن طريق المجهري في الوقت الحقيقي أبوبتوتيك. هذا البروتوكول يمكن التحقيق في الآليات وراء قمع النقوي المستحثة بخلية T الخلية وتقييم المركبات تهدف إلى تجديد خلايا T عن طريق الحصار المفروض من الخلايا المناعية النقوي القمعية.
Abstract
التقوية لقدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا في الأورام، جنبا إلى جنب مع أي تسلل الورم فعالة، عنصر أساسي في نجاح إيمونوثيرابيس. أشارت عدة دراسات إلى أن خلايا الورم النقوي المتسللة (مثلاً، القامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس) والمرتبطة بورم الضامة (تامس)) قمع سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا في ورم المكروية، وأن استهداف ويمكن تحسين هذه الخلايا التنظيمية النقوي إيمونوثيرابيس. هنا، فإننا نقدم نظاما لفحص في المختبر لتقييم الآثار القمعية محصنة من مونوسيتيك مدسكس وتامس على قدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن أولاً مثقف السذاجة CD8 الطحال+ تي الخلايا مع تفعيل الأجسام المضادة-CD3/CD28 في وجود أو عدم وجود خلايا القامع، وثم شارك مثقف الخلايا T مفعّلة مع الخلايا السرطانية الهدف حضور فلوروجينيك الركيزة caspase-3. تم الكشف عن الأسفار من الركازة في خلايا السرطان بالفحص المجهري fluorescence في الوقت الحقيقي كمؤشر تي خلية الناجم عن ورم الخلايا المبرمج. في هذا التحليل، يمكننا بنجاح الكشف عن الزيادة في ورم الخلايا المبرمج من CD8+ تي الخلايا وقمعه من قبل الثقافة مع تامس أو مدسكس. هذا التحليل الوظيفي مفيد للتحقيق CD8+ تي الخلية آليات قمع الخلايا النقوي التنظيمية وتحديد الأهداف دروجابل للتغلب عليه عن طريق فحص إنتاجية عالية.
Introduction
فمن المعروف أن CD8+ تي الخلايا يمكن القضاء على الخلايا السرطانية عند أنها تمارس الكامل سيتوتوكسيسيتي. بعد تنشيط مستقبلات خلية تي (تكر)، CD8+ تي الخلايا تتكاثر وتفرق في خلايا المستجيب السامة للخلايا. CD8 توسيع وتنشيط+ تي الخلايا تفرز حبيبات السامة للخلايا، بما في ذلك بيرفورين وجرانزيميس، التي يتم نقلها إلى الخلايا المستهدفة وبدء مسارات الحال مختلفة مثل caspase-3 بوساطة المبرمج1. CD8+ تي الخلايا يمكن أيضا حمل ورم الخلايا المبرمج بتنشيط مستقبلات على الخلايا المستهدفة، مثل مستقبلات لعامل نخر الورم-α (تنف-α)، المبرمج أول إشارة يجند (فصل)، أو يجند الذي يحفز المبرمج تنف المتصلة (درب). وعلاوة على ذلك، CD8 المنشط+ تي الخلايا تفرز الانترفيرون γ (IFN-γ) التي يمكن قمع انتشار الخلايا السرطانية وزيادة حساسية الخلايا السرطانية إلى CD8+ تي الخلايا عن طريق المتابعة-التنظيم مستقبلات فصل1. نظراً لإمكانية CD8+ ر قدرة قتل الورم، عدة استراتيجيات لتعزيز سيتوتوكسيسيتي بهم (مثل مثبطات حاجز التطعيم ضد مرض السرطان، والتبني نقل مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) معربا عن خلايا تي) قد أنشئت وتظهر الآثار العلاجية الهامة في أنواع معينة من السرطان2. مع ذلك، تتراكم الأدلة تشير إلى أن التسلل إلى الورم المناعي الخلايا مثل الخلايا التائية التنظيمية والقامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس)، والمرتبطة بورم الضامة (تامس) يمكن قمع CD8+ تي الخلية وظائفها وتحد من فعالية إيمونوثيرابيس3،،من45. لتحسين هذه إيمونوثيرابيس، فإنه من المهم أن نفهم القامع كيف مأمن حد الخلايا CD8+ سيتوتوكسيسيتي خلية تي. تحديد CD8+ خلية T آليات قمع فضلا عن أهداف دروجابل للتغلب على ذلك، سوف يتطلب تطوير واستخدام لفحوصات في المختبر.
الأسلوب المعيار الذهبي لقياس CD8+ سيتوتوكسيسيتي تي خلية هو فحص الإصدار الكروم فيها خلايا إطلاق المسبار المشعة (51Cr)، من المستهدف أن يتم تفكيك من CD8+ تي الخلايا، وهو مصمم6. بيد أن هذا التحليل له عدة عيوب منها حساسية منخفضة نسبيا، خلفية عالية، وعدم القدرة على كشف مبكر أبوبتوتيك الأحداث، ومشاكل التخلص الخطرة، ومحدودة التوافق مع معالجة السائل الآلي والكشف عن دعم تطبيقات إنتاجية أعلى. أسلوب شائع آخر هو تحليل تدفق سيتوميتريك فيها الكشف عن المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة بواسطة annexin V ملزمة7. في هذا التحليل، فمن الممكن للكشف عن معلمات أخرى مثل موت الخلية المستهدفة باستخدام يوديد propidium (PI) أو 7-أمينواكتينوميسين د (7-الإغراق) وتنشيط الخلية المستجيب وأشار إلى تعبير CD107a أو CD69، بالإضافة إلى المبرمج في الخلايا الهدف7 . بيد أن هذا التحليل يتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا القامع مقارنة بفحص الإصدار الكروم. ويتطلب أيضا مفرزة وتصنيف الخلايا الهدف ملتصقة ويمكن هذا التحيز في النتائج. في الواقع، الكروم الإصدار المقايسة أو الإنزيم سيتوميتريك تدفق لا تستخدم عادة للتحقق من القامع خلية التأثيرات على وظائف الخلية T. بدلاً من ذلك، كثيرا ما يستخدم قياس انتشار تي خلية المؤشرة تمييع صبغة الفلورسنت (مثلاً، كفسي) محملة مسبقاً في الخلايا T لتقييم تثبيط CD8+ الدالة T الخلية من الخلايا القامع. الكشف عن إنتاج IFN-γ من خلايا تي مثقف أسلوب قياسي آخر لتقييم آثار القامع الخلايا في خلية تي التنشيط8،9. ومع ذلك، النتائج من هذه الاختبارات لا ترتبط بالضرورة بالخلية الهدف قتل قدرة CD8+ تي الخلايا.
نحن الحاضرين هنا تحليل وظيفية بديلة لتقييم آثار القامع الخلايا، لا سيما الضامة في أورام المنتشر، على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا. يحدد هذا الأسلوب سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا، مثقف مسبقاً مع أو بدون الخلايا القامع حضور الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل، عن طريق الكشف عن ورم الخلايا المبرمج، يتبين من الأسفار من فلوروجينيك caspase-3 الركيزة6 استخدام الآلي الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (الشكل 1). هذا البروتوكول له العديد من المزايا مقارنة بالأساليب الأخرى؛ أنه يتطلب سوى عدد صغير من الخلايا وتمكن من كشف موت الخلايا السرطانية ملتصقة بحساسية عالية، يمكن الصور في الوقت الحقيقي المستجيب بهدف التفاعل وقابلة للفحص عالية الإنتاجية.
في هذا البروتوكول، والمرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs) وعلى السلف مونوسيتيك-مدسكس (M-مدسكس) المعزولة من الأورام المنتشر في الفئران تستخدم كخلايا القامع. في نماذج الماوس من سرطان الثدي المنتشر، يتسم عدد متميز من الضامة F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cمنخفضة تتراكم في الرئة تتضمن الأورام النقيلي. هذا السكان بلعم القليلة الموجودة في الرئة طبيعية وهكذا دعا الضامة المرتبطة بورم خبيث (MAMs)10. في هذه النماذج الماوس، آخر النقوي الخلية السكان، تعريفها F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cعالية، كما يتراكم أساسا في الرئة المنتشر حيث أنها تثير MAMs11. استناداً إلى خصائصها، قد تمثل CD11bعاليةLy6Cعالية مام السلف الخلايا مدسكس م12.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستند هذا الأسلوب على ثقافة المشارك منفصلة خطوتين: شارك استزراع CD8+ تي الخلايا مع خلايا القامع محتملة، وشارك استزراع CD8 ‘مشروطة مسبقاً’+ تي الخلايا مع الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 1). ثقافة المشاركة والخطوة الأولى مماثلة تماما لتلك ل CD8+ تي الخلية فحوصات الانتشار التي تستخدم عادة لتحديد تأثير الخلايا القامع على CD8+ الدالة T الخلية. ومع ذلك، انتشار الخلايا T لا يرتبط دائماً مع ما سيتوتوكسيسيتي. على سبيل المثال، نجد أن ثقافة المشارك مع M-مدسكس أو MAMs زادت بدلاً من انخفاض انتشار CD8+ تي الخلايا حضور CD3/CD28 تنشيط الأجسام المضادة (تكميلية الشكل 3)، بينما هذه مشروطة مسبقاً CD8+ خلايا تي أظهرت انخفاض سيتوتوكسيسيتي ضد الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 4، رقم 5، رقم 6). هذه النتائج الضوء على أهمية تقييم النشاط الوظيفي، يدل على ذلك الهدف سرطان الخلية المبرمج، يقدمها هذا CD8+ الإنزيم سيتوتوكسيسيتي خلية تي.
لقد حددنا في هذا التحليل، أن CD8+ تي الخلايا يتطلب حوالي 15 ح ثقافة التعاون من أجل حمل أقصى المبرمج للخلايا السرطانية الثديية الماوس E0771-جي (الشكل 5). قد يكون هذا التأخير بسبب الفارق بين الاتصال الأولى من خلايا المستجيب مع الأهداف وتشكيل المشبك المناعية المصاحبة لها، فضلا عن الوقت اللازم لحمل إشارات apoptotic في أهداف مقاسة بتفعيل caspase-3 (التكميلية الفيلم 1 ). كما حددنا التي بلغ عدد الخلايا السرطانية apoptotic هضبة بعد 24 ساعة، الذي على الأرجح بسبب القضاء على الأهداف من قبل خلايا تي و/أو فقدان إشارة الفلورسنت من الخلايا الميتة. هذه القدرة على تحديد وقت الذروة المبرمج هو واحد الميزة الرئيسية لهذا التحليل منذ تحديد نقطة الوقت الأمثل هام لمناسبة إجراء المقارنات بين الأوضاع المختلفة. في حالتنا هذه على سبيل المثال، الاختلاف في سيتوتوكسيسيتي بين التحكم CD8+ T وخلايا CD8 ببوركينا/مام-تعليما+ ر كان أكبر بكثير في 15-18 ح ح 72 (الشكل 5) بالمقارنة مع الخلايا، وهكذا نقطة نهاية تجربة استخدام فترة حضانة ح 72 سيؤدي إلى نتائج مضللة.
هذا الأسلوب يمكن أيضا تصور تفاعل الخلية المستجيب للهدف في الوقت الحقيقي، مما يتيح زيادة ثاقبة الآلية الكامنة وراء سيتوتوكسيسيتي محدودة من CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع خلايا القامع. على سبيل المثال، لاحظنا أن CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع M-مدسكس أو MAMs مصادفة وتتفاعل مع الخلايا السرطانية الهدف لكن ليس الحث المبرمج (التكميلية الفيلم 4، 5 فيلم التكميلية، التكميلية الفيلم 6) على الدوام. على الرغم من أننا عدم التحديد الكمي لهذا الحدث، سيكون ممكناً ومثيرة للاهتمام قياس ومقارنة نسبة لقاءات ووقتهم التفاعل في ترابط مع التعريفي المبرمج. ميزة رئيسية أخرى أن هذا الأسلوب يتطلب عدد صغير من الخلايا (مثلاً، 1 × 103 الهدف) و 4 × 103 خلايا المستجيب للبئر الواحد. في الواقع، هذا البروتوكول يمكن أن يكون كذلك المنمنمة لتنسيق لوحة 384، حسنا إذا رغبت في ذلك. ولذلك، هذا التحليل مناسبة لفحص إنتاجية عالية وتجارب حيث تقتصر أرقام الخلية مثل الاختبار في المختبر باستخدام خلايا الثمينة المستمدة من المجراة في أو السابقين فيفو العينات.
من ناحية أخرى، حد من التحليل الحالي هو وجود إعداد كبيرة من الخلايا الميت المستجيب في بعض الظروف. من أجل زيادة الدقة في التمييز بين المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة من المستجيب CD8+ تي الخلايا، نواة المسماة الخلايا المستهدفة، ونواة تقييد حجم (باستثناء خلايا المستجيب) هو تطبيق لتحليل البيانات في هذا الفحص (الشكل 2). ومع ذلك، هناك بعض الحالات حيث تراكب مجاميع (الأخضر) أبوبتوتيك CD8+ تي الخلايا على الخلايا السرطانية المستهدفة غير أبوبتوتيك، الذي قد يتيه النتائج. يمكن تخفيف هذا القيد باستخدام عمود إزالة خلية ميتة على المستجيب الخلايا قبل ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية المستهدفة، مع افتراض تتوفر إعداد كافية من الخلايا المستجيب. مع نظم الفحص المجهري أكثر تعقيداً، قد أيضا يكون من الممكن خفض إشارة إيجابية زائفة بوسم المستجيب CD8 الخلايا+ ر مع فلوروفوري متميزة من نواة الخلية المستهدفة والركيزة caspase-3 فلوروجينيك.
حتى الآن، وقد استخدمت هذا البروتوكول للتحقيق في التفعيل غير محددة مستضد CD8+ تي الخلايا. على الرغم من أن مدسكس وتامس في ورم المكروية قمع وظائف الخلية T من خلال آليات غير محددة مستضد، مدسكس في الأنسجة اللمفاوية المحيطية قمع ردود الخلية T في طريقة محددة مستضد18. للتحقيق في وظائف المناعة القمعية لهذه الأنواع من الخلية، مقايسة انتشار في المختبر استخدام CD8 الخلايا+ ر من 1 بعد التمديد ويشيع استخدام الفئران المعدلة وراثيا. في هذا التحليل، الخلايا T OT-1 (التعبير عن مستقبلات خلية تي معينة أوفالبومين (OVA)) شارك تستزرع مع مدسكس القامع حضور الببتيدات البويضات، وهو المطبق للثقافة الأولى في أعمالنا بالانزيم سيتوتوكسيسيتي (أي.، خلايا تنشيط تي في وجود أو عدم وجود المكثفات). كما أنه من الممكن التلاعب بالخلايا السرطانية المستهدفة للتعبير عن البويضات، مما يمكن أن يؤدي إلى قتل الخلية السرطان حدة مستضد خلايا “تي” 1 بعد التمديد. ولذلك، المقايسة سيمكن أيضا التحقيق في قمع مام/ببوركينا-بوساطة محددة مستضد تي خلية التنشيط. من الممكن أيضا تطبيق الفحص للتحقيق في الخلايا البشرية، وتنشيط الأجسام المضادة ضد البشرية CD3 و CD28 متوفرة تجارياً، كما تم وضع بروتوكول لعزل تامس البشرية من العينات السريرية المقررة19.
جماعياً، هذا التحليل هو تنوعاً تماما ويمكن استخدامها لدراسة سيتوتوكسيسيتي لأنواع أخرى من الخلايا المناعية. حاليا، في مختبراتنا، فإنه يجري توسيع لدراسة الخلية تعتمد على مستضد سيتوتوكسيسيتي تحت ظروف مختلفة وهو يجري أيضا وضع للإنتاجية العالية الفرز.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة ويلكوم ترست (101067/Z/13/Z (برنامج العمل المشترك)، 109657/Z/15/Z (المعارف التقليدية)، 615KIT/J22738 (المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة)، ولجنة نهر الميكونج (MR/N022556/1 (برنامج العمل المشترك، المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة). شركة نفط الشمال العراقية ودس الاعتراف بدعم من “المظهرية فحص مركز فينوميكس اكتشاف المبادرة الوطنية” والمملكة المتحدة بحوث السرطان (NOC)
Materials
| 0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
| 1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
| 2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
| 5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
| 96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
| 96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
| AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
| AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
| anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
| APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
| Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
| Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
| Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
| IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
| IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
| L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
| Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
| NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
| PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
| Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
| : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |
References
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).
- Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9. , 14 (2018).
- Tanaka, A., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Cell Research. 27, 109-118 (2017).
- Fleming, V., et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression. Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).
- Cassetta, L., Kitamura, T. Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy. Immunology. 155, 285-293 (2018).
- Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates. Methods. 31, 120-126 (2003).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).
- Azimi, M., et al. Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells. Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).
- Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions. Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, e6562 (2009).
- Kitamura, T., et al. Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer. Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).
- Bronte, V., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nature Communications. 7, 12150 (2016).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).
- Choppa, P. C., et al. Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome. Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).
- Cassetta, L., et al. Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages. Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).
