במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

1. הכנת ארון אבטחה II (BSC) הערה: בשיטות המתוארות פרוטוקול זה צריך להתנהל עם ציוד מגן אישי, תוך שימוש שיטות מעבדה כדי להשיג את הטכניקה aseptic. הרם הזכוכית מגן BSC לגובה ההפעלה, הפעל זרימה שכבתית האוהדים. השתמש תמיסה מימית של אלכוהול איזופרופיל 70% כדי לבצע מחיקה תברואה של אזור העבודה. לנגב BSC מן הקיר האחורי והקירות הצדדיים ולעבוד אל הבסיס. למחוק את כל החומרים אשר ישמש את הבדיקה עם אלכוהול 70% (אלכוהול איזופרופיל או EtOH) ומניחים בפנים BSC. 2. האדם Fibroblasts עורי זריעה בבקבוקון T75 להשיג בקבוקונים עם הקו הרצוי תא cryopreserved (neonatal האנושי עורי fibroblasts [hDFn], התא ריכוז של תאים 500,000/מבחנה, ועל המעבר p3 – p5). הצב בקבוקון עם תאים בתוך אמבט מים 1.0 ס מעמוק ב 37 ° C כדי לאפשר מפשיר. הפשרת המבחנה עד כ- 70% של פתרון תא נוזלי. לנגב את המבחנה עם אלכוהול 70% ולמקם המבחנה בדרגש המבחנה בתוך BSC.הערה: ודא מים אינו בא במגע עם הליכי משנה או שווי של המבחנה למניעת זיהום פוטנציאליים במהלך תא זריעה. למנוע מפשיר מלאה של תאים במים אמבטיה כמו הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום מוות של תאים לא מכוונת. לצייר את 10 מ”ל של מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS). להשתמש pipettor אוטומטי עצה פיפטה של 10 מ”ל לרוקן לתוך הבקבוק T75 תרביות רקמה. לאפשר המדיה באופן מלא עיתוני הבסיס + בקבוקי שתייה צידניות במוזיקת בעדינות את הבקבוק אחורה וקדימה. . בקבוקון פתוח עם מניות תא פתרון וביופסיה של המבחנה, להיות קשובה של מהירות pipetting, כמו קרום התא תהיה פגיעה של הקפאה קריוגנית העברת תאים בקבוקון רקמות T75 עם מדיה. הוצאה תא המופשרים לתוך הבקבוק רקמות, שוב להיות קשובים מהירות pipetting.הערה: זריעה צפיפות של תאים בתוך הרקמה הבקבוק מוערכת להיות תאים/cm 6,6002. זריעה צפיפות יכול להשתנות כדי להכיל את המשתמש ואת התזמון הרצוי של ניסויים. למדוד את 1 מ”ל של המדיה מן הבקבוק רקמות T75 ולהעביר נפח בחזרה לתוך המבחנה. להעביר נפח מ המבחנה בחזרה לתוך הבקבוק T75.הערה: ביצוע שלב זה מסייעת למקסם את התשואה תא המבחנה. להדק את הפקק של הבקבוק תרביות רקמה, רוק בעדינות לפיזור אחיד של תאים ההשעיה על פני כל. בדוק גם חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. תווית הבקבוק עם סוג התא, התאריך, ראשי תיבות, שושלת היוחסין, המטרה (למשל, hDFn, 07/11/2018, NDC, פסקה 4, ארסן לגרד Assay). למקם את הבקבוק תרביות רקמה חממה humidified-CO 37 ° C ו- 5.0%2 עבור 72 h.הערה: מדיום הגידול צריך להיות שונה 12-24 שעות לאחר זריעה הראשונית כדי להסיר כמויות קטנות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) cryopreservative ולאחר מכן השתנה כל 48 שעות אחרי זה כדי להבטיח תאים מוזנים כראוי. תקופת דגירה וגידול תלויות מחושב מספר התאים הדרושים וזמינותו מאפס. זמן ההכפלה תאים hDFn הוא בדרך כלל 16-24 h בתנאים רגילים. עם זאת, הכפלת קצב עשויים להשתנות עקב העלאת ה-pH, טמפרטורה, לחות, סוג המדיום, וכו ‘, ואני חייב להיות אחראים בעת תכנון ניסויים. 3. תא סופר ו תת-תרבות לתוך רקמות 12-ובכן תרבות צלחת לאחזר את הבקבוקון תרביות רקמה T75 חממה. להתבונן מודבקת תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 10 X אובייקטיבית (100 X הגדלה סה כ) ולקבוע את המפגש תא משוער. סרוק את הרוב המכריע של הבקבוק תרביות רקמה בעת התבוננות זרימה כדי להבטיח את האחוז קנאס מוערכת. הערכת מורפולוגיה תא בודד על חריגות, או על זיהום חיידקי או פטרייתי. להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה של 10 מ”ל. השתמש pipettor האחות נפח מלא של מדיה מן הפתרון T75 והעברה פח אשפה. למנוע את הטיפ pipet פנייה אל פני השטח adhering של התא. להתעלם פיפטה עצה בתוך סל חומרים מסוכנים. להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה 5 מ. האחות 5 מיליליטר תמיסת מלח מאוזנת, לוותר על הבקבוק, רוק בעדינות את הבקבוק לשטוף מדיה עודפי תאים מתים, תוצר הפסולת. שואבים את עוצמת הקול T75, לוותר על תוך המיכל פסולת. למחוק את הטיפ פיפטה לפח חומרים מסוכנים. להרכיב את pipettor אוטומטי עם מתאם פיפטה 5 מ. האחות 2 מ של טריפסין במלאי, לוותר על הבקבוק, רוק בעדינות את הבקבוק כדי לפזר את האנזים על התאים מודבקת. ודא רוויה מלאה של המשטח חסיד. מקם את הבקבוקון רקמות החממה במשך 2-3 דקות (דקות).הערה: התגובה סובסטרט המרבי לא יעלה על 10 דקות. לבחון את הבקבוקון רקמות תחת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה גדולה 10 X עדשה אובייקטיבי (100 X הגדלה סה כ). החל לתנודות העדינות כדי להקל על ניתוק התא. נגב את הבקבוקון T75 עם אלכוהול 70% והמקום פנימה BSC. להרכיב את pipettor אוטומטי עם טיפ פיפטה 5 מ. האחות 5 מ של מדיה מן המלאי ולהוסיף הבקבוקון רקמות T75 לעצור את התגובה סובסטרט. היחס מדיה: טריפסין צריך להיות 3:1. Pipet לכל אורך הבסיס + בקבוקי שתייה צידניות 2 – 3 פעמים כדי לשטוף ולהבטיח תגובת הופסקה. האחות האחסון מלאה של נוזל מן הבקבוק העברת לתוך צינור חרוטי סטרילי 15 מ”ל. למלא צינור חרוטי השני 15 מ”ל עם אמצעי אחסון זהה של מדיה. מקום שני צינורות חרוט 15 מ”ל במצב antipodal אחד לשני. החל 200 גרם של כוח צנטריפוגלי למשך 5 דקות 25° c על-ידי הגדרת פרמטרי הפעלה של ציוד. לנגב את הצינור חרוט 15 מ”ל עם מגורען תאים עם אלכוהול 70% ומניחים בפנים BSC. השתמש את pipettor אוטומטי עם קובץ מצורף מ ל כדי pipet את התקשורת, משאיר מאחור כ-250 µL של נוזל ותא גלולה. שים לב למיקום של הטיפ pipet, כפי בגדר תא תישאר ללא הפרעה. לוותר על אמצעי האחסון שנאספו לתוך מיכל פסולת וזורקים את הקצה בתוך סל חומרים מסוכנים. השתמש מתלה צינור microcentrifuge לפעול התחתון של צינור חרוטי ברחבי החריצים המבחנה, ויוצרים תנודה מהירה, כדי להפריע והשהה מחדש בגדר תא (לעתים נקרא “ארון תקשורת וגרף”).הערה: הימנע משימוש מערבל מערבולת לבצע שלב זה. כוחות הכבידה שנוצרו על-ידי מערבולת מיקסרים לחרוג תא g-force ספי והוא יכול לגרום lysing. כאשר הושלמה כראוי, הפתרון הסלולרי החדש יופיע תערובת מעונן עם אין גלולה הנותרים. בדיקות נאותות ביצוע שלב זה תיצור לרוב השעיה תא בודד, שמוביל דיוק רב יותר בעת ספירת תאים. להוסיף 2 מ”ל של מדיה תא מניות או resuspension. Pipet התאים בעדינות במורד הצד של הצינור 20 פעמים כדי לשבור את כל הגושים. נפח התאים הכולל ההשעיה ולהקליט להפריש בקצרה. Pipet 20 µL של מניות Trypan Blue (0.4%) לבאר הריק של צלחת 96-ובכן באמצעות pipet סטרילי. מערבבים הפתרון תא מניות ליצירת השעיה תא אחיד לפני ההעברה. השתמש טיפ pipet סטרילי כדי להסיר µL 20 מניות תא (הימנעות לגעת בקירות הצינור). הוסף µL 20 בפתרון Trypan Blue בצלחת 96-ובכן. Pipet בעדינות כדי לערבב תוכן. Pipet 10 µL של תערובת בין coverslip את ספירת קאמרית על hemocytometer. לבחון את התאים ואת הרשת תחת מטרה X 10. להתבונן תשעה ריבועים גדולים בתוך שדה הראייה. לספור תאים רק ב המרכז, פינה 4 ריבועים (סה כ 5 ריבועים).הערה: חפש התפלגות אחידה של תאים ברחבי הרשת כולה כדי להבטיח ספירה מדויקת. לספור את כל התאים (שקוף וכחול) המשבצות מזוהה 5 של הרשת. ספירה בנפרד, רק התאים (כחול) nonviable ב 5 ריבועים אותו. לחשב באמצעות ספירת התאים קיימא:איפה x = ספירת התאים קיימא, = סה כ תאי, b = תאים כלכלית לחשב את צפיפות התאים קיימא באמצעות:איפה x = צפיפות התאים קיימא ו- y = סכום הכולל התאים קיימא. לחשב את התאים קיימא הכולל:איפה x = סך התאים קיימא, y = צפיפות התאים קיימא, f = נפח התאים ההשעיה (מ”ל). חישוב הכדאיות תא %:איפה x = תא אחוז הכדאיות, y = התאים קיימא לסמוך על רשת, f = הכולל תאים לסמוך על רשת. לסמן קו אופקי לרוחב החלק התחתון של הלוח 12-טוב כדי לשמש סימוני הפניה במהלך דימות. להשתמש את צפיפות התאים קיימא (המחושב 3.3.7) לחישוב הנפח של המדיה כדי לדלל תא מניות עבור זריעה צלחת תרביות רקמה 12-. טוב.הערה: תא אופטימלית זריעה צפיפות של תאים hDFn היא תאים/ס מ 5,0002. לדלל המניה תאים תאים למ”ל 19,000 באמצעות מדיה, כל טוב עם 1 מ”ל של מניות תא זרע. מערבבים תא מניות מעת לעת כדי להבטיח אפילו תא זריעה על פני כל בארות 12. תווית כל צלחת עם סוג התא, שושלת היוחסין, משתמש ראשי התיבות של המטרה. מקום צלחות החממה נקבע ל- CO 37 ° C ו- 5.0%2. מאפשרים לתאים לגדול עד 100% הנהרות מושגת עבור assay מאפס. 4. ארסן (As) פתרונות מניות וחישובים לדלל נתרן arsenite (NaAsO2) ישירות לתוך התא מדיה תרבות עם 10% FBS בריכוזים עבודה של 10, 1.0, 0.1 מיקרומטר 0.01 בתור. בשביל זה, הפוך של המניות הראשונית 1 מ”מ כפתרון על ידי דילול 3.9 מ ג נתרן arsenite לתוך 30 מ של מדיה. באופן סדרתי לדלל את המניה 1 מ”מ עבור שאר כפתרונות. 1000 מיקרומטר כמו מניות חישובים ארסן עובד ריכוזים מניות 1V M1=2V M2 נפח של פתרון ארסן הקודם נפח של המדיה הנפח הכולל של ארסן עובד המניות משקל מולקולרי של NaAsO2 : 129.9 גר’/מול 10 מיקרומטר כמו (x מ”ל) (1,000 מיקרומטר) = (30 מ ל)(10 µM) x = 0.3 mL mL 0.3 = 300 µL של 1 מ מ כפתרון מ. ל 29.7 מדיה 30 .03 L x.001 מול/ליטר x 130 גרם/מול… = 3.9 מ ג של ארסן מיקרומטר 1.0 כמו (x מ”ל) (10 מיקרומטר) = (30 מ ל)(1 µM) x = 3 מ ל 3 מיליליטר 10 מיקרומטר כפתרון 27 מ”ל של מדיה 30 לדלל 3.9 מ ג נתרן arsenite לתוך המדיה 30 מ מיקרומטר 0.1 כמו (x מ”ל) (1 מיקרומטר) = (30 מ ל)(0.1 µM) x = 3 מ ל 3 מ ל 1 מיקרומטר כמו 27 מ”ל של מדיה 30 מיקרומטר 0.01 כמו (x מ”ל) (0.1 מיקרומטר) = (30 מ ל)(0.01 µM) x = 3 מ ל 3 מ”ל של 0.1 מיקרומטר כמו 27 מ”ל של מדיה 30 טבלה 1. מניות ארסן, דילולים טורי. השולחן הזה מסביר את החישובים המשמש ליצירת הפתרונות מניות כמו ועבודה מלאי פתרונות עבור קבוצות הטיפול. 5. לגרד Assay טכניקה וזיהום ארסן להשיג צלחת 12-ובכן עם תאים של החממה. להציג תאים 10 X הגדלה אובייקטיבית (100 X הגדלה סה כ). לקבוע תא זרימה בתוך כל טוב.הערה: כל בודדים טוב חייב להגיע למפגש 100% לפני גירוד. שלב קריטי זה מבטיח עקביות בתוך וזמינותו ומסייעת לתקנן assay פרוטוקולים לאורך ניסויים. אם כל בארות לא הגיעו למפגש 100%, מאפשרים לתאים תקופת דגירה של זמן נוסף עד כל בארות הגיעו למפגש 100%. צמיחה נוספים פעם הבארות שכבר הגיעו למפגש 100% לא יושפעו. תאים confluent בדרך כלל הופכים הצמיחה נעצרה ולהישאר כתרבות טפט, תוך מתן אפשרות תת confluent בארות להגיע למפגש 100%. להרכיב pipettor אוטומטית עם טיפ פיפטה של 10 מ”ל. האחות התקשורת צמיחה מתוך כל בארות. השלך את עוצמת הקול של פסולת נוזלית, הטיפ פיפטה בסל הנגועים. להרכיב את pipettor p200 עם טיפ סטרילי של µL 1-200. כל היטב, לייצר שריטה “הפצע מעושה” מאת דאייה הטיפ פני תא מ-בשעה 12 למיקום-שעה 6.הערה: שלושה גורמים שישפיעו באופן משמעותי על עקביות הן מהירות, לחץ והזווית עצה. השריטה צריכה להתבצע במהירות, ובלחץ קבוע, בעת היותו מודע הזווית עצה נשאר מאונך לבסיס של הצלחת. גירוד לאט מדי יגרום קווים עקומים, לחץ עודף יכול לצמיתות ציון תא הקפדה משטחים, זווית עצה של פחות מ- 90° תצמצם את רוחב מאפס. כל אלה טעויות נפוצות יכול לגרום ההעברה שינו מחירים ודוגמאות. ברור משם גושים פסולת ותא עודף על ידי שטיפה עם 1 מ”ל של תמיסת מלח מאוזן לכל טוב. רוק צלחת–לצד כדי להקל על הכביסה. הסר את תמיסת מלח מאוזנת מבארות והיפטרו במיכל אשפה. השלך הטיפ פיפטה 5 מ”ל לפח הנגועים. איור 1: ייצוג סכמטי של גירוד וזמינותו. כל העבודה נעשית בתוך שדה aseptic כדי להקטין את הסיכוי לזיהום. תאים נזרע על צפיפות הרצוי בתרביות רקמה מבחנות, גדל באינקובטור להגדיר תנאים הפיזיולוגיות אנושיים (5% CO2, 37 ° C). כשמגיעים זרימה הרצוי, תאים גילוח ורחיצה כירורגית תת מתורבתים תרביות רקמה. ובכן 12 לוחות-צפיפות זריעה הרצוי. התאים גדלים הנהרות 100% כל היטב של לוח 12-ובכן שרוט באמצעות טיפ pipet סטרילי. זה “שריטה” יוצר במבחנה מעושה פצע (מסומן על ידי חץ נוסעים כפול), שבו תאים באופן טבעי להגר לסגור את שטח פתוח. כל אחד גם יכול להיות ייחודי מותנה, הגירה הסלולר המחירים ניתן להקליט ולצפות במעשיהם לכמת בתגובה לתנאי טיפול שונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להשתמש pipettor p1000 עם טיפ 1,000 µL pipet 1,000 µL של ארסן מניות לתוך בארות שהוקצו באופן אקראי עם קבוצת הטיפול. השתמש טיפ pipet חדש עבור כל טוב למניעת זיהום לחצות. רשום את הזמן כאשר טיפולים נוספים. מקום טוב 12 צלחות אינקובטור להגדיר ב- CO 37 ° C ו- 5.0%2. 6. הדמיה לכידת תמונות של כל אחד טוב-10 X הגדלה אובייקטיבית כל 4 שעות במשך 24 שעות ביממה (0, 4, 8, 12, 16, 20, ו-24 שעות). להפנות קו שצויר בעבר על החלק התחתון של צלחת לשיקוף באותו המיקום לאורך השריטה בתוך מכל קידוח בנקודות זמן עוקבות.הערה: זה הכרחי כי באותם מיקומים מצטלמים בכל נקודה בזמן כדי לאפשר ניתוח מדויק תמונות וכדי לקבל נתונים נציג. 7. ניתוח תמונות להעלות תמונות שנתפסו על מיקרוסקופ אור הפוך למחשב ולשמור כתמונת JPEG עם שם קובץ מפורט. פתח ImageJ. להעלות תמונה של מיקרומטר הבמה עם מרחקים מוכרות התוכנה כדי להמיר פיקסלים מילימטר (מ מ) כאשר לוקחים מידות התמונה על-ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון התוכנה.הערה: מיקרומטר צריך יש קווים התוחם באורך ידוע 1 מ מ, יש לקחת את התמונה בהגדלה אותו להשתמש כדי ללכוד תמונות של תאים. לדוגמה, במחקר זה התמונות צולמו ב 100 X הגדלה הכולל, ובכך התמונה של מיקרומטר הבמה נלקח ב- 100 X הגדלה הכולל. לחץ על האפשרויות ישר, Segmentedאו קווים חופשיים . למתוח קו של מרחק ידוע על התמונה מיקרומטר באמצעות השנתות-באורך משויך לכל שנתות סימני. כדי לצייר קו ישר: לחץ על העכבר, להחזיק, גרור את הסמן במיקום הרצוי, ואז שחרר העכבר. בחר נתח ולאחר מכן בחר לקבוע קנה מידה. הגדר מרחק ידוע ידוע אורך קו שצויר בשלב הקודם. הגדר אורך מ מ. סמן את התיבה גלובלית. בחר אישור כדי לצאת מתוך התפריט. לסגור התמונה מיקרומטר הבמה. להעלות תמונה assay שריטה אחת לתוך ImageJ על-ידי גרירה של יורד קובץ תמונה לתוך החלון. לצייר קו ישר לרוחב השריטה (מתוך הקצה המוביל שמאלה אל הקצה המוביל ימינה). הקש על האות M במקלדת כדי להקליט את המדידה של קו ישר שצויר. חלון תוצאות קטן יופיע מיד לאחר הקלדת האות M. . זה איפה תהיה מדידת רוחב. חזור על שלב 7.4 סך של 10 פעמים כדי לקבל 10 מדידות לאורכו של השריטה.הערה: חשוב ליצור ערכי רוחב הייצוגי ביותר למטה לכל אורכה של השריטה. הקפד מרחף את מידות רוחב 10 שווה לאורכו של השריטה מלמעלה עד למטה. צור קובץ הגיליון האלקטרוני assay מאפס כדי להעתיק ולהדביק את המידות. העתק והדבק את מידות רוחב 10 מתוך חלון תוצאות העמודות המתאימות בקובץ הגיליון האלקטרוני (טבלה 2).הערה: כאשר המידות מועתקות מתוך חלון תוצאות ומודבקות לתוך הגיליון, יהיו עמודות מיותר של ערכים; ערכים אלה יש למחוק, לשמר רק את מידות רוחב 10. מידות רוחב אקראי 10 הו 4 שעות 8 שעות 12 שעות 16 h 20 h h 24 שעות ביממה 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ממוצע של מדידות 10 בטבלה 2. מידות רוחב raw שולחן עיצוב. טבלה זו מראה המבנה הארגוני על המדידות raw שהושג. חזור על השלב הנ ל למשך שאר הדימויים assay מאפס. לחשב את הממוצע של המדידות 10 בכל נקודה בזמן (0-24 h) עבור כל טוב. לקבוע אחוז סגירת חישובים באמצעות ערכים משלב 7.8. יצירת טבלה בתחתית הגיליון האלקטרוני שכותרתו “רוחב מדידה ממוצעים” (טבלה 3). העתק והדבק שורת ממוצע של מדידות 10 מחושבת באופן צעד 7.8 לתוך הטבלה “מדידת הרוחב הממוצע”. צור טבלה אחרת ליד השולחן רוחב מדידה ממוצעים . כותרת זו טבלת אחוזים פצע הסגר (טבלה 4).הערה: הערך בעמודה 0 h עבור כל טוב צריך להיות 0 כי השריטה היא 0% סגר ב התמונה הראשונית h 0 עבור כל בארות. נווט לעמודה הבאה מעל (4 שעות). לחשב הסגר אחוז עבור 4, 8, 12, 16, 20 ו- 24 h נקודות זמן:איפה, x = אחוז סגירת מעגל, אני = רוחב הטיוטה הראשונית (0 h רוחב), f = רוחב הטיוטה הסופית (4, 8, 12, 16, 20 או 24 h רוחב). ובכן רוחב ממוצעים הו 4 שעות 8 שעות 12 שעות 16 h 20 h h 24 שעות ביממה 1a 2a 3 א 4a 1b 2b 3b 4b 1c 2 ג 3c 4c בטבלה 3. מדידת הרוחב הממוצע בתבנית טבלה. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני הממוצעים מדידת רוחב מחושב באמצעות המדידות raw רוחב בטבלה מס ‘ 2. . טוב הו 4 שעות 8 שעות 12 שעות 16 h 20 h h 24 שעות ביממה 1a 0 2a 0 3 א 0 4a 0 1b 0 2b 0 3b 0 4b 0 1c 0 2 ג 0 3c 0 4c 0 בטבלה 4. אחוז פצע בתבנית טבלה הסגר. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני עבור הערכים סגירת הפצע אחוז מחושב באמצעות מדידת הרוחב הממוצע בטבלה3. צור טבלה אחרת ליד השולחן אחוז סגירת הפצע . כותרת זו טבלה חאן (טבלה 5). לחשב את 0-4 אזור h תחת הערך העקומה (AUC) ב- 0-4 העמודה h עבור כל טוב:איפה x = 0-4 h חאן אל הערך, = % ערך סגירת מעגל עבור 0 h, b = % ערך הסגר במשך 4 שעות, h = הזמן בין האמצעים שני (4 h במחקר זה). לחשב את השטח 4-8 h תחת הערך העקומה (AUC) בעמודה h 4-8 עבור כל טוב:איפה x = 4-8 h חאן אל הערך, = % ערך הסגר במשך 4 שעות, b = % ערך סגירת מעגל עבור 8 שעות, h = הזמן בין האמצעים שני (4 h במחקר זה).הערה: ערך חאן אל אחד יש לחשב עבור כל מרווח זמן של 4 שעות על התקופה 24 שעות ביממה במשך כל. לסכם את כל הערכים חאן אל מ h 0-24 (המחושב צעדים 7.10.1-7.10.2) כדי לקבל ערך חאן אל מסוכם עבור כל טוב. ודא שערכים אלה נשמרים כראוי לשם ניתוח סטטיסטי. . טוב 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h חאן אל מסוכם 1a 2a 3 א 4a 1b 2b 3b 4b 1c 2 ג 3c 4c טבלה 5. חאן אל תבנית טבלה. טבלה זו מציגה את המבנה הארגוני עבור הערכים חאן אל מחושב באמצעות האחוזים פצע הסגר ערכים בטבלה4. 8. ניתוח סטטיסטי לקבוע את שיטת ניתוח סטטיסטי המתאימה ביותר עיצוב ניסיוני והן מסוכם חאן אל הערכים שהתקבלו במהלך וזמינותו.