比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

1. 培地の準備 細胞培養培地 (血清含有培地) をするためには、500 mL の蒸留水にイーグル MEM 粉末の 4.7 g を追加します。20 分せ部屋の温度中クール 120 ° c のオートクレーブ。ウシ胎児血清を追加 (最終濃度: 10%)、L-グルタミン (2 mM)、ペニシリン ストレプトマイシン (1%)、炭酸水素ナトリウム (1.125 g/L)。1 月に 4 ° C で保存します。 前述の手順 1.1 でなくウシ胎児血清ウイルス伝搬の無血清培地を準備します。1 月に 4 ° C で保存します。 プラクの試金のイーグル MEM 培地 (フェノールレッドを非含む) 100 mL をオートクレーブで滅菌します。させる中、室温に冷却し、2% を追加売却、2% ペニシリン ストレプトマイシン、4 mM L-グルタミンと 2.25 g/L NaHCO3。4 ° C でのストア プラクの試金のためのオートクレーブで 2.5% の agarose のゲル 100 mL を滅菌します。プラクの試金を行った同じ日にゲルを準備します。水お風呂に 47 ° C でゲルを格納します。 2. 細胞培養 液体窒素容器から MA104 細胞を含む cryotube を削除します。細胞の解凍が 37 ° C で水のお風呂に、cryotube を配置します。T75 フラスコで血清含有培地 20 mL に 1 mL の細胞懸濁液を追加します。2 または 3 日間で 37 ° C、5% CO2インキュベーターでフラスコを孵化させなさい。注:懸濁液に最終濃度は約 106セル/mL です。 単層細胞が 80% の confluency に達すれば、上澄みを除去し、ダルベッコ PBS (リン酸緩衝生理食塩水) x 1 の 5 mL で 2 回洗浄を行う。 フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA の 4 mL を追加し、フラスコから細胞をデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。15 mL チューブ 190 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。 上澄みを廃棄し、血清を含む培地で準備 1.1 の 1 mL の播種細胞 (106細胞) を再懸濁します。再懸濁細胞を 100 倍希釈培地とします。 6 ウェル用プラクの試金) または (の細胞接着アッセイ) 24 ウェル プレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液 3 mL をそれぞれ追加します。2 または 3 日間飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% でインキュベーターの版を孵化させなさい。注:T75 フラスコ培養上清中容量 (30 mL) と比較して上清 (1 mL) のサンプル ボリュームを無視できますので時間コース サンプルの収集に適しています。一方、それぞれの上清にウイルスの感染力価は 6 ウェル プレートは通常行なわれるプラクの試金によって測定されます。24 ウェル プレートは、セル結合の試金に利用されます。 3 ロタウイルスの特定の成長率 注:アカゲザルのロタウイルス (RRV、遺伝子型: RRV 迅速かつ容易に MA104 細胞とプラークを形成できますので、G3P[3]) はこのプロトコルに利用されています。 解凍する場所 37 ° c の水浴中-80 ° C で保存無血清培地でウイルスの懸濁液 (107 pfu/mL) の 1 mL を含むチューブ。ブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。30 分間飽和蒸気下で CO2を 37 ° C および 5% のウイルス懸濁液を孵化させなさい。注:他のソースからトリプシンを使用できますが、ロタウイルス感染に及ぼす影響を事前にテストする必要があります。 活性化ウイルス懸濁液 0.1 pfu/細胞への感染 (MOI) の多様性を調整する無血清培地を希釈します。 (2.1) をめっきセル後 3 日 T75 フラスコの MA104 細胞 (80% 合流) に希釈ウイルスの懸濁液の 1 mL を追加、37 ° C 1 時間インキュベート、フラスコ 15 分毎を軽く振る。 フラスコにブタ膵臓由来トリプシンの 0.13 μ g/mL を含む無血清培地 30 mL を加えます。飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% でフラスコを孵化させなさい。 0、6、12、18、24 でフラスコの上清 1 mL と 36 (または 48) h 後感染 (hpi) を収集し、ピペットを使用して 1.5 mL チューブに上清を置き換えます。 凍結 (-80 ° C) を行い、3 回 37 ° C サイクルで湯せんで溶かします。4 ° C で 10 分間 12,600 x gでチューブを遠心分離します。上清を収集します。 細胞画分を除去する蒸留水 0.2 μ m フィルターで上清をフィルター処理します。ウイルス力価を測定のプラクの試金に適用するまで冷蔵庫に保管して上澄み-80 ° C。 37 ° C の水浴中で収集した上清 (ステップ 3.5) を含むチューブを配置します。10 倍希釈試料 1 mL に 4 μ g/mL のトリプシンを追加し、37 ° C、30 分インキュベートします。 3.8、30 分インキュベーション中に開始時間コース サンプル (ステップ 3.5) から得られたウイルスの力価を測定のプラクの試金を洗って 6 ウェル プレート 2 ml の 1x PBS で 2 回 MA104 細胞血清含有培地を削除した後。 直列無血清培地で培養サンプルを希釈し、各ウェルに希釈試料 1 mL を接種します。37 ° C および 5% CO2飽和蒸気下で 90 分間プレートをインキュベートし、プレート 15 分毎を軽く振る。 インキュベーション後、接種を 6 ウェル プレートから取り外します。(手順 1.3) で調製した培地に 4 μ g/mL のトリプシンを追加します。優しく、即座に各ウェルに agarose のゲル (比率は 1:1) 混合培地 3 mL を追加します。 (Agarose のゲルは固体になる) まで 10 分以上室温でプレートを維持し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で 2 日間インキュベートします。注:井戸の端から寒天培地と混合媒体を注ぐ。 各ウェルに 1x PBS で希釈した 0.015% 中性赤溶液の 1 mL を追加し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。3 h 後染料を削除し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で 1 日間インキュベートします。 次の日は、各ウェルに斑の数をカウントし、pfu/mL を計算します。プラークの数を確保するためにプラクの試金する前にセルの合流を入念にチェックします。 4 セル結合の試金 注:このプロトコルは、Gilling のレポート13に基づいています。 (2.1 と同じ方法) にブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。1 pfu/セルの MOI を調整する無血清培地にウイルス懸濁液を希釈します。 24 ウェル プレート トリス緩衝生理食塩水 1 ml を 2 回 MA104 細胞を洗い流し (TBS; 2.53 g/L トリス基地、6.54 g/L の NaCl、KCl、0.3 g/L 0.046 g/l の Na2HPO4蒸留水 1 L に到達する)。 セル、24 ウェル プレートの各ウェルに希釈したウイルスを懸濁液 100 μ L を接種して, 穏やかな振動 15 分毎との 90 分のための 4 ° C で。 ウイルスの接種材料を削除し、TBS の 1 mL で 2 回洗浄を行う二本鎖 (ds) RNA のロタウイルスを抽出する 140 μ L の PBS x 1 と 560 μ L の RNA 抽出バッファーを追加 (材料の表を参照) を各ウェル。ピペット (10 x について、またはヘイズやバッファー内セルの汚染物質は発生しませんまで) で十分に混ぜます。 製造元のプロトコルに従って二重鎖 RNA (dsRNA) を回復した後、dsRNA を変化させなさいすぐに氷の上にチューブを配置し、2 以上インキュベートに 5 分間、95 ° C で熱ブロックの dsRNA の抽出物を含む 1.5 mL チューブを配置します。分。 逆のトランスクリプションを使用して cDNA を合成キット (材料の表を参照してください)。変性のウイルス RNA 溶液の 4 μ L を加える混合物 (表 1) の 16 μ l を含む PCR チューブと泡を生成しないようにピペット慎重に混ぜます。スピン ・ ダウン チューブ。 表 2に示す条件下でサーマルサイクラーと逆のトランスクリプションを実行します。CDNA をすぐに使用しない場合は、最長 1 年間、-20 ° C で cDNA を含む PCR チューブを格納します。 量的な PCR のプライマーを使用 (前方 5′-ACCATCTACACATGACCCTC-3’、逆; 5′-GGTCACATAACGCCCC-3′)14と逆を挿入するプローブ (qPCR プローブ; 5′-/ファム/ATGAGCACA/クェンチャー/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/タムラ/3 ‘)、ターゲット、963-ロタウイルスの NSP3 ゲノム セグメントの 1049 領域 (GenBank ST3 株: X81436)。注: クェンチャーが曽ら14によって設計されたプローブ挿入します。 標準プラスミドを連続的に希釈 (101 106コピー/ml) PCR とグレードの qPCR の混合物 (表 3) に水と qPCR 次の表 4のマスター ミックス (20 μ L/サンプル) を作る。 96 ウェル PCR プレートのほかにマスター ミックスの 20 μ L を追加し、10 回のピペッティングにより cDNA サンプルの 5 μ L、5 μ L 標準プラスミドをミックスします。表 4に示す条件によると qPCR システムの反応を開始します。 MA104 細胞表面にバインドされているロタウイルス ゲノムを計算するには、標準的なプラスミッドの既知ゲノム全塩基数の Ct 値と線形回帰を行いサンプルのゲノム数を見積もる。初期接種 (G0)、細胞 (Gt) にウイルス粒子番号バインディングの比率を計算します。