Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

1. orta hazırlık Bir hücre kültür orta (serum içeren orta) yapmak için 500 mL distile su 4.7 g kartal MEM tozu ekleyin. Otoklav 120 ° c 20 dk ve oda sıcaklığında orta soğumaya bırakın. Fetal Sığır serum ekleyin (son konsantrasyonu: % 10), L-Glutamine (2 mM), penisilin streptomisin (% 1) ve sodyum bikarbonat (1,125 g/L). 4 ° C’de 1 ay için saklayın. Serum-Alerjik orta adım 1.1 ama fetal Sığır serum olmadan açıklandığı gibi virüs yayma için hazır olun. 4 ° C’de 1 ay için saklayın. Plak tahlil için kartal MEM Orta (sigara içeren fenol red) 100 mL tarafından ısıyla sterilize. Orta serin oda sıcaklığına ve % 2 eklemek izin FBS, %2 penisilin streptomisin, 4 mM L-glutamin ve 2.25 g/L NaHCO3. 4 ° C’de mağaza Plak tahlil için 100 mL % 2.5 özel jel otoklav tarafından sterilize. Jel plak tahlil yapılır aynı gün hazırlayın. 47 ° C’de jel bir su banyosunda saklayın. 2. hücre kültürü Sıvı azot konteyner MA104 hücre satırlarını içeren bir cryotube kaldırın. Cryotube su banyosu 37 ° C’de hücreler çözülme yerleştirin. Hücre süspansiyon 1 mL T75 şişe serum içeren ortamda 20 mL ekleyin. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye için 2-3 gün kuluçkaya.Not: Son hücre süspansiyon içinde yaklaşık 106 hücre/mL bölgedir. Hücre monolayer % 80 confluency ulaştığında, süpernatant kaldırmak ve iki kez 5 mL 1 x Dulbecco’nın PBS (fosfat tamponlu tuz) de içeren hücreleri yıkayın. Şişesi için 4 mL % 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve şişeye hücrelerden ayırmak 5 min için 37 ° C’de kuluçkaya. Hücre süspansiyon 15 mL tüp ve 5 min için 190 x g, santrifüj aktarın. Süpernatant atın ve 1 mL serum içeren orta hazırlanan 1.1 pelleted hücrelerde (106 hücreleri) resuspend. Resuspended hücreleri, 100-fold seyreltik orta ile. Seyreltilmiş hücre süspansiyon 3 mL 6-iyi (için plak tahlil) veya 24-şey tabak (hücre-bağlama tahlil) için her şey sırasıyla ekleyin. Bir kuluçka doymuş buhar altında 37 ° C ve % 5 CO2 tabak için 2-3 gün kuluçkaya.Not: Bir T75 şişesi süpernatant (1 mL) örnek hacmi toplam süpernatant birime (30 mL) göre göz ardı edilemez çünkü zaman ders örnekleri toplamak uygundur. Bu arada, her süpernatant virüs bulaşıcı titresi genellikle 6-şey plaka kullanılarak yapılır plak tahlil tarafından ölçülür. 24-şey plaka hücre bağlayıcı tahlil için kullanılmaktadır. 3. belirli büyüme hızının Rotavirüs Not: Rhesus Rotavirüs (RRV, genotip: G3P[3]) RRV plaklar MA104 hücreleri ile hızla ve kolayca oluşturabilir çünkü bu protokol için kullanılmaktadır. Erimek için bir yer 37 ° C’de bir su banyosunda-80 ° C’de depolanan serum serbest ortamda virüs süspansiyon (107 pfu/mL), 1 mL içeren bir tüp. 1 µg/µL tripsin domuz pankreas virüs süspansiyon (son tripsin 4 µg/mL bölgedir) ve sonra girdap için 1 mL ekleyin. Doymuş buhar için 30 dk altında 37 ° C ve % 5 CO2 virüs süspansiyon kuluçkaya.Not: Tripsin diğer kaynaklardan kullanılabilir ancak Rotavirüs infektivite etkisi önceden test edilmesi gerekiyor. Enfeksiyon (MOI) 0.1 pfu/hücreye çeşitliliğini ayarlamak için bir serum-Alerjik orta ile aktif virüs süspansiyon sulandırmak. 1 mL sulandırılmış virüs süspansiyon MA104 hücre (% 80 birleşmesi) bir T75 şişesi 3 gün sonra (2.1) kaplama hücre ekleme, 1 h için 37 ° C’de kuluçkaya ve yavaşça salla şişeye her 15dk. Sonra bir domuz pankreas dan tripsin şişeye için 0,13 µg/mL içeren bir serum-Alerjik orta 30 mL ekleyin. Doymuş buhar altında 37 ° C ve % 5 CO2 şişeye kuluçkaya. 1 mL 0, 6, 12, 18, 24, şişeye süpernatant ve 36 (ve/veya 48) s sonrası enfeksiyon (HPI) toplamak ve süpernatant bir pipet kullanarak 1,5 mL tüpler değiştirin. Dondurma (-80 ° C) yapmak ve bir su banyosunda 37 ° C döngüsünde üç kez eritebilir. 12.600 x g 4 ° C’de 10 dakika için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant toplamak. Süpernatant hücre kesir kaldırmak için distile 0.2 µm filtre ile filtre. Süpernatant-80 ° C virüs titresi ölçmek için plak tahlil uygulamak kadar buzdolabında saklayın. Toplanan süpernatant (adım 3.5) 37 ° C’de bir su banyosunda içeren tüpler yerleştirin 4 µg/mL tripsin 10 kat seyreltilmiş örnek için bir 1 mL ekleyin ve 30 dk 37 ° C’de kuluçkaya. 3,8, 30 dk kuluçka sırasında saat ders örnekleri (adım 3.5) elde edilen virüs titresi ölçmek için plak tahlil başlamak için MA104 hücrelerde iki kez 6-şey plaka 2 mL 1 x PBS ile serum içeren orta çıkardıktan sonra yıkayın. Seri olarak serum-Alerjik orta ile inkübe örnekleri sulandırmak ve 1 mL sulandırılmış örneğinin her kuyuya aşılamak. 90 dk 37 ° C ve doymuş buhar altında % 5 CO2 plaka kuluçkaya ve plaka her 15 dakikada hafifçe çalkalanır. Kuluçka sonra inoculum 6-şey plaka kaldırın. (Adım 1.3) hazırlanan orta 4 µg/mL tripsin ekleyin. Yavaşça ama hemen her şey için (oran 1: 1’dir) özel jel ile karışık orta 3 mL ekleyin. (Özel jel katı hale gelinceye kadar) plaka daha–dan 10 dakika oda sıcaklığında tutmak ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında 2 gün kuluçkaya.Not: Kuyunun kenarından agar ile karışık orta dökün. 1 mL 1 x PBS için her şey ile seyreltilmiş %0,015 tarafsız kırmızı çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında kuluçkaya. Boya 3 h sonra çıkarın ve 37 ° C ve % 5 CO2 doymuş buhar altında 1 gün kuluçkaya. Ertesi gün, her iyi plaklar saymak ve pfu/mL hesaplayın. Hücre izdiham plak numaraları sağlamak için plak tahlil önce dikkatlice kontrol edin. 4. hücre bağlayıcı tahlil Not: Bu protokolü Gilling’ın raporu13tarihinde dayanır. 1 µg/µL tripsin bir domuz pankreas virüs süspansiyon (son tripsin 4 µg/mL bölgedir) ve sonra girdap için 1 mL (2.1 aynı şekilde) ekleyin. 1 pfu/hücre MOI ayarlamak için bir serum-Alerjik orta ile virüs süspansiyon sulandırmak. Sonra MA104 hücreleri Tris tamponlu tuz 1 ml ile 24-şey plaka üzerinde iki kez yıkayın (TBS; 2.53 g/L Tris taban, 6,54 g/M NaCl, 0.3 g/L KCl, 0,046 g/l 1 L distile su ile ulaşmak için Na2HPO4 ). Her şey bir 24-şey plaka hücreleri ile seyreltilmiş virüs süspansiyon 100 µL aşılamak ve nazik her 15dk sallayarak ile 90 dakika, 4 ° C’de kuluçkaya. Virüs inoculum kaldırmak ve hücreleri TBS. 1 mL ile iki kez yıkamak Çift iplikçikli Rotavirüs (ds) RNA ayıklamak için 1 PBS x 140 µL ve RNA ayıklama arabelleği 560 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her şey için. Yeterli bir pipet (10 x hakkında veya sis veya kirletici hücre arabellek görmedim kadar) ile karıştırın. Üreticinin protokolüne göre çift iplikçikli RNA (dsRNA) geri aldıktan sonra yer dsRNA, tabiatını ve sonra hemen tüpler buza koyun ve fazla 2 için kuluçkaya 5 min için 95 ° c ısı blokta dsRNA özü içeren 1,5 mL tüpler Min. Ters transkripsiyon kullanarak cDNA sentez ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Denatüre viral RNA çözüm 4 µL 16 µl karışımı (Tablo 1) içeren bir PCR tüp ve dikkatle kabarcıklar oluşturmamanız bir pipet ile karıştırın. Tüpler spin. Tablo 2′ de gösterilen koşul altında termal cycler ile ters transkripsiyon gerçekleştirin. CDNA hemen kullanılmazsa cDNA-20 ° c ilâ 1 yıl için içeren PCR tüp depolamak. Astar kantitatif PCR için kullanın (ileri; 5′-ACCATCTACACATGACCCTC-3′, ters; 5′-GGTCACATAACGCCCC-3′)14 ve bir içki ekleme bir araştırma (qPCR sondalar; 5′- / FAM/ATGAGCACA/içki/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3′), hedefleme 963-1049 bölge NSP3 genom segmentin Rotavirüs, (ST3 zorlanma, GenBank: X81436).Not: İçki Zeng vd.14 tarafından tasarlanmış sonda eklenir Standart plazmid seri olarak sulandırmak (101 106 kopya/ml) PCR ile hemzemin su qPCR karışıma (Tablo 3) ve ana mix (20 µL/örnek) Tablo 4takip qPCR için yapmak. 20 µL ana karışımı bir 96-şey PCR tabak iyi ve 10 kez pipetting tarafından cDNA örnekleri 5 µL veya standart plazmid 5 µL karıştırın. QPCR sistem Tablo 4′ te gösterilen koşullara göre tepki başlar. MA104 hücre yüzeyine bağlı Rotavirüs genom hesaplamak için standart bir plazmid bilinen genom sayısı Ct değerleri arasındaki doğrusal regresyon kuralları ve örnek’ın genom numarasını tahmin ediyoruz. Sonra bu ilk inoculum (G0) virion numaraları bağlama hücrelere (Gt) oranını hesaplamak.