Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Syun-suke Kadoya; Daisuke Sano

doi:10.3791/58821

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunologie et infection

Анализы для конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции

Published: January 28, 2019

doi:

10.3791/58821

Syun-suke Kadoya¹, Daisuke Sano^1,2

¹Department of Civil and Environmental Engineering,Tohoku University, ²Department of Frontier Science for Advanced Environment, Graduate School of Environmental Studies,Tohoku University

Summary

Здесь мы представляем два протокола, один для измерения определенных темпов и другой для способности клеток привязки ротавирусной инфекции, используя assay металлической пластинкы и RT-ПЦР. Эти протоколы доступны для подтверждения различий в фенотипов ротавирусной штаммов.

Abstract

Ротавирусной является основным этиологическим фактором для инфантильных понос. Это (ds) двуцепочечной РНК вируса и формирует генетически различных слоев населения, известный как quasispecies, ввиду их высокой мутации ставки. Здесь мы опишем, как измерить конкретные темпы и способность клеток привязки ротавирусной его фенотипов. Ротавирусная трактуется с трипсином признать клеточный рецептор и затем прививку в культуре клеток MA104. Супернатант, включая вирусный потомков, собирается с перерывами. Assay металлической пластинкы используется для подтверждения титр вируса (металлическ формируя единица: ОРП) из каждого собранного супернатант. Конкретные прирост оценивается путем установки времени курс данные ОРП/мл для измененной модели Гомпертца. В assay клетки привязки MA104 клетки в пластине 24-ну инфицированных ротавирусной и инкубированы для 90 мин при 4 ° C для адсорбции ротавирусной клеточными рецепторами. Низкая температура сдерживает ротавирусной инфекции от вторжения клетки-хозяина. После мытья удаление несвязанных вирионы, РНК добывается из вирионы придает рецепторы клеток, следуют синтеза cDNA и реверс транскрипция количественного PCR (RT-ПЦР). Эти протоколы могут применяться для расследования фенотипические различия между вирусных штаммов.

Introduction

РНК-вирусов формируют генетически различных слоев населения, известный как quasispecies¹, потому что их ставка мутации,² , которая выше, чем у организмов, на основе ДНК. Структура населения в quasispecies зависит от генетических факторов народонаселения, включая мутации, давление отбора и генетического дрейфа. Штаммов в пределах одной генетической линии может показать разные фенотипы вследствие генетического разнообразия. Например Rachmadi et al. показали, что чувствительность свободного хлора разных мышиных норовирус штаммов, которые возникли от налета Очищенный сорт S7-PP3³.

Ротавирусы (род ротавирусной инфекции в семье Реовирусы) являются не охватило ds РНК вирусов, образуя quasispecies². Помимо населения генетические факторы, описанные выше геном реаасортации влияет генетического разнообразия ротавирусной, потому что этот вирус имеет 11 сегментированный геном⁴. Ротавирусы причиной диареи главным образом среди детей, и детская смертность в 2013 году были оценены около 250 000⁵. Две вакцины используются в ряде стран и была эффективной в снижении бремени ротавирусной инфекции, но некоторые исследователи сейчас обсуждаем присутствие вакцины побег мутантов,⁶^,⁷^,,⁸^, ⁹. характеристика этих мутантов имеет важное значение для понимания механизмов вакцины бежать.

Здесь мы представляем протоколы для двух анализов для оценки конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции для того чтобы понять фенотипические различия среди штаммов/мутантов. Кривая роста Ротавирусы была представлена в предыдущих докладах¹⁰, но обычно не измеряются параметры роста таких конкретных прирост. Клетки привязки пробирного проведенных ранее включает immunofluorescent окрашивание техника¹¹. Мы показываем здесь проще методы использования assay металлической пластинкы и RT-ПЦР, которые позволяют количественно обсуждать разницу в вирусные фенотипы. Эти методы подходят для характеристики ротавирусной фенотипы и наконец может способствовать строительству новых вакцин эффективны для нескольких генотипов.

Protocol

1. Средний подготовка Чтобы сделать средство культуры клеток (сыворотка содержащих средний), добавьте 4,7 г орла MEM порошка в 500 мл дистиллированной воды. Обработайте автоклавированием при температуре 120 ° C в течение 20 мин и пусть средних остыть до комнатной температуры. Добавить плода бычьим сывороточным (конечная концентрация: 10%), L-глютамин (2 мм), пенициллин, стрептомицин (1%) и бикарбонат натрия (1.125 г/Л). Хранить при 4 ° C на 1 месяц. Подготовьте сыворотки бесплатная среда для размножения вируса, как описано в шаге 1.1, но без плода бычьим сывороточным. Хранить при 4 ° C на 1 месяц. Для assay металлической пластинкы стерилизация автоклавированием 100 мл орла MEM среды (не содержащих фенол красный). Пусть средний остыть до комнатной температуры, а затем добавить 2% FBS, 2% стрептомицин, пенициллин, 4 мм L-глютамина и 2,25 г/Л NaHCO3. Хранить при 4 ° C. Для assay металлической пластинкы стерилизации 100 мл 2,5% агарозном геле в автоклаве. Подготовка геля в тот же день проводится assay металлической пластинкы. Храните гель на 47 ° C на водяной бане. 2. клеточная культура Удаление cryotube, содержащих MA104 клеточных линий из контейнера жидкого азота. Поместите cryotube в водяной бане при 37 ° C таять клетки. Добавьте 1 мл суспензии клеток в 20 мл сыворотки содержащих среды в колбе T75. Инкубируйте колбу в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на 2 или 3 дней.Примечание: Около 106 клеток/мл концентрация окончательный клеток в суспензии. Как только монослой клеток достигает 80% confluency, удалить супернатант и вымыть клетки дважды с 5 мл 1 x Дульбекко в PBS (-фосфатный буфер). Добавить 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу и инкубировать при 37 ° C за 5 мин до отсоединения клетки из колбы. Передать суспензию клеток 15 мл трубки и центрифуги на 190 x g за 5 мин. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулированных клетки (106 клеток) в 1 мл сыворотки содержащих средних подготовленных в 1.1. Разбавить ресуспензированы клетки в 100 раз с носителя. Добавьте 3 мл суспензии разреженных клеток в каждой скважине 6-ну (для assay металлической пластинкы) или 24-ну пластины (для assay клетки привязки), соответственно. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров для 2 или 3 дней.Примечание: T75 колбу подходит для сбора образцов курс, потому что объем образца супернатант (1 мл) может быть проигнорировано по сравнению с общим объемом супернатанта (30 мл). Тем временем инфекционные титр вируса в каждом супернатант измеряется assay металлической пластинкы, которая обычно проводится с помощью 6-ну тарелку. 24-ну плита используется для assay клетки привязки. 3. конкретные темпы ротавирусной инфекции Примечание: Ротавирусная резус (RRV, генотип: G3P[3]) используется в настоящем Протоколе, потому что RRV можно быстро и легко образуют бляшки с MA104 клетками. Место трубка, содержащая 1 мл суспензии вирус (107 ОРП/мл) в сыворотке бесплатно средней температуре-80 ° C в водяной бане при 37 ° C, чтобы разморозить. Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря. Инкубируйте вирус подвеска при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров на 30 мин.Примечание: Трипсина из других источников могут быть использованы, но эффект на ротавирус инфективности должен испытываться заранее. Разбавьте активации вируса подвеска с сыворотка свободный средних регулировать кратность инфекции (МВД) 0.1 ОРП/ячейку. Добавить 1 мл суспензии разреженных вирус MA104 клеточных линий (80% притока) в колбе T75 3 дней после ячейки покрытия (2.1), инкубации при 37 ° C для 1 h и осторожно встряхните флакон каждые 15 мин. Затем добавьте 30 мл сыворотки свободный носитель, содержащий 0,13 мкг/мл трипсина из поджелудочной железы свиней в колбу. Инкубируйте настой при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров. Сбор 1 мл супернатант в колбу на 0, 6, 12, 18, 24 и 36 (или 48) h послеоперационные инфекции (hpi) и заменить супернатант в 1,5 мл пробирок с помощью пипетки. Проведение заморозки (-80 ° C) и расплавить на водяной бане при 37 ° C цикла три раза. Затем центрифуга трубы на 12600 x g 10 мин при 4 ° C. Соберите супернатант. Фильтр супернатант с дистиллированной 0.2 мкм фильтр, чтобы удалить часть клетки. Храните супернатанта-80 ° C в холодильнике до применения к assay металлической пластинкы для измерения титр вируса. Место труб, содержащий собранные супернатант (шаг 3.5) в водяной бане при температуре 37 ° C. Добавить 4 мкг/мл трипсина в 1 мл раствора десятикратного разреженных образца и инкубировать при 37 ° C за 30 мин. В течение 30 минут инкубации в 3.8 чтобы начать assay металлической пластинкы для измерения титр вируса, полученные от времени курс образцов (шаг 3.5), вымойте клетки MA104 дважды в 6-ну плита с 2 мл ПБС после удаления сыворотки содержащих среднего. Серийно разбавить инкубирован образцы сыворотки бесплатно среднего и прививать 1 мл разбавленной пробы в каждой скважине. Инкубировать пластину для 90 минут при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров и осторожно встряхивайте пластину каждые 15 мин. После инкубации удалите посевным материалом с 6-ну пластины. Добавьте 4 мкг/мл трипсина в средних, подготовленный в (шаг 1.3). Мягко, но сразу же добавьте 3 мл среды, смешанного с геля агарозы (соотношение составляет 1:1) в каждую лунку. Держите пластины при комнатной температуре для более чем 10 мин (до тех пор, пока гель агарозы становится твердой) и проинкубируйте 2 дней при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров.Примечание: Залейте средство, смешанного с агар от края колодца. Добавьте 1 mL 0,015% нейтральные красный раствор разбавляют с ПБС в каждой скважине и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров. Удаление краски через 3 ч и инкубировать 1 день при 37 ° C и 5% CO2 под насыщенных паров. На следующий день, подсчитать количество бляшек в каждой скважине и рассчитать ОРП/мл. Тщательно проверьте слияния клеток перед assay металлической пластинкы заверить налета чисел. 4. клетки привязки Assay Примечание: Этот протокол основан на докладе Gilling13. Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря (таким же образом как и 2.1). Разбавьте вирус подвеска с сыворотки свободный среднего для регулировки MOI 1 ОРП/клетка. Затем, вымыть клетки MA104 дважды на 24-ну пластины с 1 мл трис амортизированное saline (TBS; 2,53 г/Л Tris база, 6.54 г/Л NaCl, 0,3 г/Л хлористого калия, 0,046 г/л Na2HPO4 до 1 Л дистиллированной водой). Прививок 100 мкл разбавленного вирус подвески для каждой скважины 24-ну плиты с клеток и Инкубируйте на 4 ° C 90 мин, с нежным пожимая каждые 15 мин. Удалите вирус посевным материалом и вымыть клетки дважды с 1 мл раствора TBS. Чтобы извлечь двуцепочечные РНК (ds) ротавируса, добавить 140 мкл 1 x PBS и 560 мкл буфера извлечения РНК (см. Таблицу материалы) для каждой скважины. Mix адекватно с пипеткой (около 10 x, или до тех пор, пока туман или загрязнения ячеек в буфере не видел). После восстановления двойной мель РНК (dsRNA) по данным производителя протокол, место 1,5 мл пробирки, содержащие экстракт двуцепочечной ДНК на блоке тепла при 95 ° C за 5 мин до денатурировать двуцепочечной ДНК, а затем сразу же место трубы на льду и инкубировать для более чем 2 мин. Синтез cDNA с помощью обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалы). 4 мкл раствора денатурированного вирусной РНК для ПЦР-пробирки, содержащие 16 мкл смеси (Таблица 1) и тщательно перемешать его с пипетку, чтобы не создавать пузыри. Спин вниз трубы. Выполнение обратной транскрипции с тепловой циклователь на условиях, показано в таблице 2. Если cDNA сразу не используется, храните ПЦР-пробирки, содержащие cDNA в-20 ° C до 1 год. Использовать для количественного PCR праймеры (вперед 5′-ACCATCTACACATGACCCTC-3′, обратный; 5′-GGTCACATAACGCCCC-3′)14 и щуп, вставив утоления (ПЦР зонды; 5′- / FAM/ATGAGCACA/утоления/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/ТАМРА-3′), ориентации 963-1049 региона NSP3 генома сегмента Ротавирусная (Ст3 штамм, GenBank: X81436).Примечание: Утоления вставляется в зонд, разработанный Цзэн et al.14 Разбавленных стандартных плазмида серийно (101 до 106 копий/мл) с ПЦР класс воду в смесь ПЦР (Таблица 3) и сделать главный микс (20 мкл/образец) для ПЦР после таблицы 4. 20 мкл мастер смеси хорошо 96-луночных ПЦР плиты, а затем смешать 5 мкл cDNA образцов или 5 мкл стандартных плазмида, закупорить 10 раз. Начало реакции ПЦР системы в соответствии с условиями, указанными в таблице 4. Чтобы вычислить ротавирусной генома, привязан к поверхности клеток MA104, проводить линейной регрессии между значениями Ct и известный геном количество стандартных плазмида и оценить количество образцов генома. Затем Рассчитайте коэффициент вириона чисел привязки к клеткам (Gt) для тех, кто в первоначальном посевным материалом (0G).

Representative Results

Обзор двух протоколов для конкретных темпов и клеток привязки assay налета-очищенная RRV штаммов показан на рисунке 1A и 2A, соответственно. В assay для определенного роста окончательный вирус титр достигает более 107 ОРП/мл при распространении на колбу T75. Если максимальная концентрация меньше чем 107 ОРП/мл, MA104 клетки не могут стать вырожденная или RRV не был активирован, трипсина. Для оценки конкретных прирост с использованием инфекционных блок данных доступны некоторые модели роста. В этом протоколе модифицированных Гомпертца модель12 используется в качестве примера; где N0 (104 ОРП/мл в этом исследовании) и Nt (104 -108 ОРП/мл) являются инфекционные титр вируса (ОРП/мл) на 0 и т (пример: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, соответственно, является асимптотического значения [журнала (N∞/n0 )] (пример: 3-4), мкг-это конкретные темпы [1/ч], e — константа Napier и λ является период задержки [h]. Параметры модели получаются путем расчета функции анализа программного обеспечения, которое уменьшает сумму квадратов разницы между значениями наблюдаемые и смоделированные. В примере на рисунке 1Bконкретные прирост (µ) оценивается в 0.197 [1/ч] и период задержки (λ)-6,61 [h], применяя метод наименее квадратных модифицированная модель Гомпертца и относительной вирус титр в стационарной фазы (начальный титр Вход шкала) (A) — 3,15 [журнала (N∞/n0)]. Мы протестировали 6 клонов ротавирусной инфекции в общей сложности, и расчетные значения конкретных прирост составлял от 0,19 до 0,27 [1/мин]. Эти расчетные значения являются надежными, потому что коэффициент определения значений в модели фурнитуры более чем 0,98. RRV вирионы привязки к поверхности клетки были около 103 копий/мл (привязка эффективность составила около 1%) при использовании 24-ну пластины для assay клетки привязки (рис. 2B). Assay обычно проводится три раза для каждого образца, и если в образец наблюдается большая вариативность в номер копии, могут возникнуть некоторые проблемы как чрезмерно мойки и недостаточно активация RRV трипсином. Значение Ct ПЦР, превышающей около 36,0 не является предпочтительным и считается ниже предела обнаружения в наших условиях ПЦР. Объем / 1 реакции 5 х PrimeScript буфера 4.0 МКЛ PrimeScript RT фермент смесь я 1.0 МКЛ Праймера Oligo dT 1.0 МКЛ Случайные 6 РВК 4.0 МКЛ Деионизированная вода дистиллированная 6.0 МКЛ ssRNA образец 4.0 МКЛ Итого 20,0 МКЛ Таблица 1: Мастер перемешать композиции для синтеза cDNA ротавирусной генома. Температуры [° C] Время 37 15 мин 42 15 мин 85 5 s 4 ∞ Таблица 2: Реакция условие для синтеза cDNA ротавирусной генома. Объем/1 реакция Taq премикс 12.5 МКЛ Грунтовка вперед (10 мкм) 0.5 МКЛ Обратный грунт (10 мкм) 0.5 МКЛ Зонд (10 мкм) 0.5 МКЛ Ссылка краситель II 0.5 МКЛ Деионизированная вода дистиллированная 5.5 МКЛ Образец cDNA 5.0 МКЛ Итого 25 МКЛ Таблица 3: Мастер перемешать состав для количественного PCR ротавирусной генома. Температуры [° C] Время 95 5 мин 94 20 s 45 цикла 60 1 мин 72 5 мин Таблица 4: Реакция условие для количественного PCR ротавирусной генома. Рисунок 1: схема обзор оценки роста ротавирусная и кривая роста ротавирусной. (A) инфекционные единица ротавирусной измеряется с assay металлической пластинкы. (B) кривой (синяя линия) была аппроксимирована модифицированных Гомпертца модели, основанной на данных наблюдений в нашей лаборатории (белый круг). Темпы роста конкретных [µ]; 0.197 [h-1], отстают в период (λ); 6.61 [h], относительная вирус титр на стационарном этапе начальный титр (логарифмическая шкала) 3.15 [журнала (N∞/n0)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Схематичный обзор и представитель результат assay клетки привязки пяти RRV штаммов, очищенного от бляшек в нашей лаборатории. (A) A клетки культуры пластины прививанным с ротавирусом инкубировали при 4 ° C для ингибирования нашествия вирусов в клетки. После инкубации и удаление несвязанных вирусных частиц клеток подсчитать количество геномов, происходящих из связанных вирусных частиц на поверхности клеток с RT-ПЦР. (B) в результате клетки привязки пробирного был отображается как binding КПД (%), который был соотношение связанных вирусных частиц для тех, кто присутствует в посевным материалом. Смелые бар: средний, конца коробки: отклонение квартиль, конец строки: максимальная и минимальная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Наш протокол для измерения темпов роста конкретных легче, чем предыдущие и могут быть адаптированы для других вирусов, если их системы культуры клеток еще не создана. В этом исследовании, мы использовали RRV (G3P[3]) потому, что этот штамм может сформировать металлические пластинкы легче, чем Ротавирусы человека при использовании MA104 клеточных линий. Некоторые штаммы человека ротавирусной не образуют бляшки в этой линии клетки. Таким образом вместо assay металлической пластинкы, фокус, образуя единицы (ФФУ) пробирного¹⁵ или медиана культуры ткани инфекционным дозы (TCID50) assay может применяться для многих ротавирусной штаммов¹⁶. Представленные протокол для определения конкретных прирост может использоваться для других типов вируса, но не подходит для вирусов, для которых создана система культуры не установленным клеток. Перед началом эксперимента для определенного роста, лучше заранее знать, когда вирус инфекционной титр начинает увеличить и достигает стационарной фазы в предварительном тесте. Если слишком много металлических пластинк присутствуют, assay металлической пластинкы должно проводиться снова после изменения расхода разрежающего образцов вируса. Часов после инфекции (hpi) для сбора проб также важны, потому что наклон фазы экспоненциального роста может быть недооценена, если пропустили точку надлежащего времени для достижения неподвижной фазой. В приближении, модифицированная модель Гомпертца коэффициент детерминации следует всегда рассчитывается и проверены. Если Фитнес для измененной модели Гомпертца является низкой, другие модели роста, такие как изменение логистической модели¹² может быть предпочтительным.

В обработке клеток, при удалении вирусов или средний посевным материалом, PBS для стирки или агарозы гель для assay металлической пластинкы должны оперативно добавлены к каждому хорошо из плиты культуры клеток для предотвращения клетки от сухости. В то же время необходимо осторожно налить PBS или агарозы для ячейки не отсоединить от скважин. Этот шаг является самым важным в обоих анализов (шаг 3.9 и 3.11). Если assay металлической пластинкы имеет слишком много образцов, мы рекомендуем разделение геля агарозы (100 мл, рекомендуется каждый максимум) в несколько средних бутылки и согреться бутылки до тех пор, пока перед использованием с агарозы гель затвердевает в течение около 10 мин на номер Температура. Так как трипсина уязвим для высоких температур¹⁷, раствором трипсина следует добавить средне и агарозы для assay металлической пластинкы после надлежащего охлаждения.

В assay клетки привязки инкубаторов для привязки вирусом клетки должно быть сделано на 4 ° C для предотвращения вторжения клеток. По словам Gilling метод¹³клетки подвержены сушка при низких температурах, так нежно тряска необходимо каждые 15 минут во время инкубации. В РНК добыча комплект использованы здесь может быть заменен на другие наборы. Наклон стандартной кривой в RT-ПЦР должно быть примерно 3.3, и коэффициент определения должно быть больше чем 0,98. По сравнению с флуоресцентным микроскопом визуализировать локализации вирусов в клетки, assay является более быстрым и проще в использовании, потому что привязка флуоресцирующих веществ для вирусов не является необходимым.

Недавно человеческой кишечника enteroid (ГИЭ), аналогичные клеточный состав и функции как человека желудочно-кишечного эпителия, стала доступна для распространения ротавируса¹⁸. Использование HIE может позволить нам оценить конкретные темпы и способность клеток привязки не culturable штаммов ротавирусной инфекции. Кроме того оба эксперименты, описанные здесь может применяться для оценки воздействия препарата на обоих фенотипов¹⁹. Здесь представлены протоколы позволяют количественно обсудить изменения в значения параметров фенотип ротавирусной штаммов в разнообразных условиях.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана «санитарии значение цепи: Проектирование систем как эко-сообщество значение канализация» проект, ResearchInstitute для человечества и природы (RIHN, No.14200107 проекта).

Materials

7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	Plaque assay
Disodium Hydrogenphosphate	Wako Pure Chemical Corporation	194-02875	Cell binding assay
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05900	Cell culture
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05901	Plaque assay
EasYFlask 75 cm2	Thermo Scientific	156499	Cell culture
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions	Gibco	10437028	Cell culture and Plaque assay
Forward / Reverse primers	Eurofins Genomics		qPCR
L-Glutamine, 200 mM Solution	Gibco	2530081	Cell culture and Plaque assay
Neutral Red	Wako Pure Chemical Corporation	140-00932	Plaque assay
PBS (-) "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05913	Cell culture and Plaque assay
Penicillin-Streptomycin, Liguid	Gibco	15140122	Cell culture and Plaque assay
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	Cell binding assay
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR039A	qPCR
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR037A	cDNA synthesis
PrimeTime qPCR Probes	Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Viral RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	RNA extraction
Sodium Bicarbonate	Wako Pure Chemical Corporation	199-05985	Cell culture and Plaque assay
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	198-01675	Cell binding assay
Tissue culture plates 24-well plate	TPP	92024	Cell binding assay
Tissue culture plates 6-well plate	TPP	92006	Plaque assay
Trizma base	SIGMA-ALDRICH	T1503	Cell binding assay
Trypsin from porcine pancrease	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	Activate for rotavirus
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red	Gibco	25300054	Cell culture
Vertical 96-Well Thermal Cycler	Applied Biosystems		cDNA synthesis

References

Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants?. Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (143), e58821, doi:10.3791/58821 (2019).