Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Syun-suke Kadoya; Daisuke Sano

doi:10.3791/58821

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunologie et infection

Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Published: January 28, 2019

doi:

10.3791/58821

Syun-suke Kadoya¹, Daisuke Sano^1,2

¹Department of Civil and Environmental Engineering,Tohoku University, ²Department of Frontier Science for Advanced Environment, Graduate School of Environmental Studies,Tohoku University

Summary

Hier presenteren we twee protocollen, één voor het meten van de specifieke groeisnelheid en de andere voor het vermogen van de cel-bindende van rotavirus met behulp van de plaque assay en RT-qPCR. Deze protocollen zijn beschikbaar voor het bevestigen van de verschillen in fenotypen rotavirus stammen.

Abstract

Rotavirus is de voornaamste etiologische factor voor infantiele diarree. Het is een RNA-virus van de double-stranded (ds) en vormt een genetisch diverse bevolking, bekend als quasispecies, vanwege hun hoge mutaties. Hier beschrijven we hoe te meten van de specifieke groeisnelheid en het vermogen van de cel-bindende van rotavirus als haar fenotypen. Rotavirus is behandeld met trypsine te herkennen van de cel receptor en vervolgens geënt in de cultuur van de cel van de MA104. De bovendrijvende vloeistof, met inbegrip van virale nakomelingschap, wordt met tussenpozen verzameld. De bepaling van de plaque wordt gebruikt om te bevestigen de titer van het virus (plaque-vormende eenheid: pfu) van elke verzamelde bovendrijvende substantie. De specifieke groeisnelheid wordt geschat door het aanbrengen van tijdsverloop gegevens van pfu/mL tot de gewijzigde Gompertz model. In de bepaling van de cel-bindende, zijn MA104 cellen in een 24-well-plate besmet met rotavirus en 90 min bij 4 ° C voor rotavirus adsorptie aan cel receptoren ge¨ uncubeerd. Een lage temperatuur weerhoudt rotavirus van de invasie van de gastheercel. Na het wassen om het verwijderen van niet-afhankelijke virionen, wordt RNA gewonnen uit virionen gekoppeld aan cel receptoren gevolgd door cDNA synthese en omgekeerde-transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR). Deze protocollen kunnen worden toegepast voor het onderzoeken van de fenotypische verschillen tussen virale stammen.

Introduction

RNA virussen vormen een genetisch diverse bevolking, bekend als quasispecies¹, vanwege hun mutaties,² die hoger is dan die van DNA gebaseerde organismen. Bevolkingsstructuur in quasispecies wordt beïnvloed door de bevolking genetische factoren, met inbegrip van mutatie, selectiedruk en genetische drift. Spanningen binnen een enkele genetische afkomst kunnen verschillende fenotypes weergegeven vanwege de genetische diversiteit. Bijvoorbeeld, bleek Rachmadi et al. vrij chloor gevoeligheid onder lymfkliertest norovirus stammen die afkomstig van een plaque-gezuiverd stam S7-PP3^{3 zijn}verschillende.

Rotavirus (geslacht rotavirus Reovirus Poaceae) zijn niet-gehuld ds RNA virussen vormen quasispecies². Naast de bevolking genetische factoren zoals hierboven beschreven, beïnvloedt genoom reassortment de genetische diversiteit van rotavirus omdat dit virus 11 gesegmenteerde genoom^{4 heeft}. Rotavirussen veroorzaken diarree vooral onder zuigelingen en zuigelingensterfte in 2013 werden naar schatting ongeveer 250.000⁵. Twee vaccins worden gebruikt in verschillende landen en effectief in het verminderen van de last van rotavirus infectie geweest, maar sommige onderzoekers debatteren nu over de aanwezigheid van vaccin-escape-mutanten⁶^,⁷^,⁸^, ⁹. de karakterisering van deze mutanten is belangrijk om te begrijpen van de mechanismen van de vaccin-escape.

We presenteren hier protocollen voor de twee tests voor de beoordeling van de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van rotavirus om te begrijpen van de fenotypische verschillen tussen stammen/mutanten. De groeikromme van Rotavirus is gepresenteerd in eerdere verslagen¹⁰, maar groeiparameters zoals specifieke groeisnelheid zijn meestal niet gemeten. Een cel-bindende bepaling uitgevoerd impliceert eerder de immunefluorescentie kleuring techniek¹¹. Wij tonen hier eenvoudiger methoden van het gebruik van de plaque assay en RT-qPCR, waarmee we het verschil in virale fenotypen kwantitatief te bespreken. Deze methoden zijn geschikt voor de karakterisatie van rotavirus fenotypes en ten slotte kunnen bijdragen tot de opbouw van nieuwe vaccins effectief voor meerdere genotypen.

Protocol

1. middelgrote voorbereiding Om een cel kweekmedium (serum-bevattende medium), voegt u 4.7 g Eagle’s MEM poeder aan 500 mL gedestilleerd water. Autoclaaf bij 120 ° C gedurende 20 min. en laat de middelgrote koel aan kamertemperatuur. Toevoegen van foetale runderserum (eindconcentratie: 10%), L-Glutamine (2 mM), penicilline streptomycine (1%) en natriumbicarbonaat (1.125 g/L). Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 maand. Het medium serumvrij voorbereiden op de verspreiding van het virus zoals beschreven in stap 1.1, maar zonder de foetale runderserum. Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 maand. Voor de bepaling van de plaque, 100 mL Eagle’s MEM medium (niet-bevattende fenol rood) te steriliseren in autoclaaf. Laat het medium afkoelen tot kamertemperatuur en voeg vervolgens 2% FBS, 2% penicilline streptomycine, 4 mM L-Glutamine en 2,25 g/L NaHCO3. Bewaren bij 4 ° C. Voor de bepaling van de plaque, steriliseren 100 mL 2,5% agarose gel door autoclaaf. Voorbereiding van de gel dezelfde dag die de plaque-test wordt uitgevoerd. Bewaar de gel bij 47 ° C in een waterbad. 2. de celkweek Verwijderen van een cryotube met MA104 cellijnen uit de vloeibare stikstof-container. Plaats de cryotube in een waterbad bij 37 ° C te ontdooien van de cellen. 1 mL van de celsuspensie aan 20 mL serum-bevattende voedingsbodem in een maatkolf van T75 toevoegen. Incubeer de kolf in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 of 3 dagen.Opmerking: De concentratie van de laatste cel in de schorsing is ongeveer 106 cellen/mL. Zodra de cel enkelgelaagde 80% confluentie bereikt, verwijder het supernatant en wassen van de cellen tweemaal met 5 mL 1 x Dulbecco van PBS (phosphate buffered saline). 4 mL trypsine-EDTA 0,05% Voeg aan de maatkolf en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen van de kolf los te maken. De celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 190 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de Ingehuld cellen (106 cellen) in 1 mL serum-bevattende middellange bereid in 1.1. Verdun de geresuspendeerde cellen op 100-fold met het medium. Voeg 3 mL van de verdunde celsuspensie aan elk putje van 6-well (voor de plaque-assay) of 24-Wells-platen (voor de cel-bindende-assay), respectievelijk. Incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp voor 2 of 3 dagen.Opmerking: Een T75 kolf is geschikt monsters te verzamelen het tijdsverloop omdat het monstervolume van het supernatans (1 mL) kan worden genegeerd in vergelijking met het totale supernatant volume (30 mL). Ondertussen, de besmettelijke titer van het virus in elke supernatant wordt gemeten door de plaque-bepaling, die is meestal uitgevoerd met een 6-well-plate. Een 24-well plaat wordt gebruikt voor de cel-bindende assay. 3. specifieke groeisnelheid van Rotavirus Opmerking: Rhesus rotavirus (RVV, genotype: G3P[3]) in dit protocol wordt gebruikt, omdat het RVV-snel en gemakkelijk plaquettes met MA104 cellen vormen kan. Plaats een buis met 1 mL van de virussuspensie (107 pfu/mL) in een serumvrij medium opgeslagen bij-80 ° C in een waterbad bij 37 ° C te ontdooien. 1 µg/µL trypsine van varkens alvleesklier aan 1 mL van de (definitieve trypsine concentratie is 4 µg/mL) virussuspensie en vervolgens vortex toevoegen. Incubeer de virussuspensie bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp gedurende 30 minuten.Opmerking: Trypsine van de andere bronnen kan worden gebruikt, maar het effect op rotavirus infectiviteit moet op voorhand worden getest. Verdun de geactiveerde virussuspensie met een serumvrij medium voor het aanpassen van de veelheid van infectie (MOI) naar 0,1 pfu/cel. 1 mL verdunde virussuspensie toevoegen aan MA104 cellijnen (80% heuvels) in een maatkolf van T75 3 dagen na de cel plating (2.1), Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur en zachtjes schudden de kolf elke 15 min. Dan, Voeg 30 mL van een serumvrij medium met 0.13 µg/mL trypsine van een varkens alvleesklier naar de kolf. Incubeer de erlenmeyer op 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp. Verzamelen van 1 mL van het supernatans dat in de erlenmeyer op 0, 6, 12, 18, 24 en 36 (en/of 48) h na infectie (hpi) en vervang de bovendrijvende vloeistof in de buizen van de 1,5 mL met behulp van een precisiepipet. Voeren van de bevriezing (-80 ° C) en smelten in een waterbad bij 37 ° C cyclus driemaal. Centrifugeer dan de buizen bij 12.600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof te verzamelen. De bovendrijvende vloeistof filteren met een gedestilleerd 0,2 µm filter te verwijderen van de Fractie van de cel. Sla het supernatant-80 ° C in de ijskast tot toe te passen op de plaque assay voor het meten van de titer van het virus. Plaatsen van de buizen met het verzamelde supernatant (stap 3.5) in een waterbad bij 37 ° C. Meng een 1 mL 10-fold verdunde monster 4 µg/mL trypsine en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Wassen tijdens de incubatie 30 min in 3.8, om te beginnen de plaque assay voor het meten van de virus-titer verkregen tijd cursus monsters (stap 3.5), de cellen van de MA104 tweemaal in een 6-well plaat met 2 mL 1 x PBS na het verwijderen van het serum-bevattende medium. Serieel Verdun de bebroede monsters met een serumvrij medium en enten van 1 mL van de verdunde monster in elk putje. Incubeer de plaat gedurende 90 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp en de plaat elke 15 min zachtjes te schudden. Na incubatie het entmateriaal uit de 6-well plaat te verwijderen. 4 µg/mL trypsine toevoegen aan het medium bereid in (stap 1.3). Voorzichtig maar meteen Voeg 3 mL van het medium gemengd met agarose gel (de verhouding is 1:1) aan elk putje. Houd de plaat bij kamertemperatuur gedurende meer dan 10 min. (pas de agarose gel solid) en incubeer gedurende 2 dagen bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp.Opmerking: Giet het medium gemengd met agar vanaf de rand van de put. Voeg 1 mL van de neutrale rode oplossing verdund met 1 x PBS aan elk putje 0,015% en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp. Verwijder de kleurstof na 3 h en incubeer gedurende 1 dag bij 37 ° C en 5% CO2 onder de verzadigde damp. De volgende dag, het aantal plaques in elk putje en bereken de pfu/mL. Controleer zorgvuldig de samenvloeiing van de cel voor de bepaling van de plaque te verzekeren van de plaque-nummers. 4. cel-bindende Assay Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op de Gilling verslag13. 1 µg/µL trypsine uit een varkens alvleesklier toevoegen aan 1 mL van de (definitieve trypsine concentratie is 4 µg/mL) virussuspensie en vervolgens vortex (op dezelfde manier zoals in 2.1). Verdun de virussuspensie met een serumvrij medium om de MOI van 1 pfu/cel. Daarna, het wassen van de cellen van de MA104 tweemaal op 24-well plaat met 1 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS; 2,53 g/L Tris baseren, 6.54 g/L NaCl, KCl, 0,3 g/L 0.046 g/l Na2HPO4 tot 1 L met gedistilleerd water). Inoculeer 100 µL van verdunde virussuspensie aan elk putje van de plaat van een 24-well met cellen en Incubeer bij 4 ° C voor 90 min, met zacht schudden elke 15 min. Verwijderen van het virus entmateriaal en wassen van de cellen tweemaal met 1 mL eetlepels Om uit te pakken van de double-stranded RNA (ds) van het rotavirus, 140 µL 1 x PBS en 560 µL van het RNA extractie buffer toevoegen (Zie Tabel van materialen) aan elk putje. Meng voldoende met een pipet (over 10 x, of totdat de nevel of verontreinigingen van cellen in de buffer wordt niet gezien). Na het herstellen van de dubbele stranded RNA (dsRNA) volgens protocol van de fabrikant, plaats de 1,5 mL buisjes met het dsRNA-extract op een warmte blok bij 95 ° C gedurende 5 min te denatureren de dsRNA, en vervolgens onmiddellijk de buizen op ijs en incubeer gedurende meer dan 2 min. CDNA synthetiseren met behulp van een omgekeerde transcriptie kit (Zie Tabel van materialen). Voeg 4 µL van gedenatureerde virale RNA-oplossing tot een PCR koker met 16 µl van het mengsel (tabel 1) en meng het zorgvuldig met een pipet om niet te genereren van bubbels. Spin down de buizen. Het uitvoeren van de omgekeerde transcriptie met een thermische cycler onder de voorwaarde in tabel 2aangegeven. Als de cDNA niet onmiddellijk wordt gebruikt, slaat de PCR-buis met de cDNA bij-20 ° C voor maximaal 1 jaar. Gebruik de inleidingen voor kwantitatieve PCR (Forward 5′-ACCATCTACACATGACCCTC-3′, omgekeerde; 5′-GGTCACATAACGCCCC-3″)14 en een sonde voor het invoegen van een quencher (qPCR sondes; 5′- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3′), gericht op de 963-1049 regio van NSP3 genoom segment van rotavirus (ST3 stam, GenBank: X81436).Opmerking: Quencher is ingevoegd in de sonde ontworpen door Zeng et al.14 De standaard plasmide serieel verdunnen (101 tot 106 kopieën/mL) met PCR rang water aan het qPCR mengsel (tabel 3) en de master mix (20 µL/voorbeeld) om het qPCR na tabel 4. Voeg 20 µL van de master mix aan het putje van de plaat van een 96-Wells PCR, en Meng 5 µL van cDNA monsters of 5 µL van het standaard plasmide door pipetteren 10 keer. Start de reactie van het systeem van de qPCR volgens de voorwaarden die zijn weergegeven in tabel 4. Voor het berekenen van het genoom van de rotavirus gebonden aan het celoppervlak MA104, voeren van de lineaire regressie tussen Ct-waarden en het aantal van de bekende genoom van een standaard plasmide en schatten van het monster genoom nummer. Vervolgens berekenen de verhouding van virion nummers binding aan cellen (Gt) die in de eerste entmateriaal (G0).

Representative Results

Een overzicht van twee protocollen voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindende bepaling van RVV stammen plaque-gezuiverd wordt weergegeven in figuur 1A en 2A, respectievelijk. In de bepaling voor de specifieke groeisnelheid bereikt de laatste virus-titer meer dan 107 pfu/mL wanneer teeltmateriaal op de T75 kolf. Als de maximale concentratie lager dan 107 pfu/mL is, de MA104 cel kan niet confluente geworden of RVV is niet geactiveerd door trypsine goed. Sommige groei modellen zijn beschikbaar voor het inschatten van de specifieke groeisnelheid met de besmettelijke eenheid gegevens. In dit protocol, is de gewijzigde Gompertz model12 werkzaam als voorbeeld; waar N0 (104 pfu/mL in deze studie) en Nt (104 tot 108 pfu/mL) zijn de virus besmettelijk titer (pfu/mL) op 0 en t (voorbeeld: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respectievelijk A is de asymptotische waarde [log (N∞/N0 )] (voorbeeld: 3 tot en met 4), µ is de specifieke groeisnelheid [1/h], e is van de Napier constante en λ is de periode van de vertraging [h]. Model parameters worden verkregen door de Oplosser-functie van de analysesoftware, die de som van de kwadraten van de verschillen tussen de waargenomen en gemodelleerd waarden minimaliseert. In het voorbeeld in figuur 1B, de specifieke groeisnelheid (µ) wordt geschat op 0.197 [1/h] en de periode van de vertraging (λ) is 6.61 [h] door het minste vierkante methode toepast op een gemodificeerde Gompertz model, en de relatieve virus titer op de stationaire fase aan de initiële titer ( aanmelden schaal) (A) is 3.15 [log (N∞/N0)]. Wij hebben 6 rotavirus klonen getest in totaal, en de geschatte waarden voor de specifieke groeisnelheid varieerden van 0,19 tot 0.27 [1/h]. Deze geschatte waarden zijn betrouwbaar, omdat de coëfficiënt van de waarden van de bepaling in het model passen meer dan 0,98 is. RVV-virionen binden aan cel oppervlakken waren ongeveer 103 kopieën/mL (efficiëntie bindend was ongeveer 1%) bij het gebruik van een 24-well plaat voor de cel-bindende assay (figuur 2B). De bepaling wordt meestal uitgevoerd drie keer voor elke sample, en als een grote afwijking in het exemplaaraantal wordt waargenomen in een steekproef, sommige problemen zoals overdreven wassen en onvoldoende activering van RVV door trypsine optreden. De Ct-waarde van qPCR meer dan ongeveer 36.0 is niet beter en is beschouwd te worden onder een detectiegrens in onze qPCR staat. Volume / 1 reactie 5 x PrimeScript Buffer 4.0 ΜL PrimeScript RT enzym meng ik 1,0 ΜL Oligo dT Primer 1,0 ΜL Willekeurige 6 mers 4.0 ΜL Gedeïoniseerd gedestilleerd water 6.0 ΜL ssRNA monster 4.0 ΜL Totaal 20,0 ΜL Tabel 1: Master mix samenstelling voor cDNA synthese van genoom van het rotavirus. Temperatuur [° C] Tijd 37 15 min 42 15 min 85 5 s 4 ∞ Tabel 2: Reactie voorwaarde voor cDNA synthese van het genoom van het rotavirus. Volume/1 reactie Premix Taq 12.5 ΜL Voorwaartse primer (10 µM) 0,5 ΜL Omgekeerde primer (10 µM) 0,5 ΜL Sonde (10 µM) 0,5 ΜL Referentie kleurstof II 0,5 ΜL Gedeïoniseerd gedestilleerd water 5.5 ΜL cDNA monster 5.0 ΜL Totaal 25 ΜL Tabel 3: Master mix samenstelling voor kwantitatieve PCR van rotavirus een genoom. Temperatuur [° C] Tijd 95 5 min 94 20 s 45 cyclus 60 1 min 72 5 min Tabel 4: Reactie voorwaarde voor kwantitatieve PCR van rotavirus een genoom. Figuur 1: Schematisch overzicht van de schatting van rotavirus groei en de groeicurve van rotavirus. (A) de besmettelijke eenheid van rotavirus wordt gemeten met de bepaling van de plaque. (B) de curve (blauwe lijn) werd benaderd door de gewijzigde Gompertz model gebaseerd op gegevens van de waargenomen in ons laboratorium (witte cirkel). De specifieke groeisnelheid [µ]; 0.197 [h-1], lag periode (λ); 6.61 [h], de relatieve virus titer op de stationaire fase aan de initiële titer (logschaal) (A); 3.15 [log (N∞/N0)]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Schematisch overzicht en representatief resultaat van de cel-bindende bepaling van de vijf stammen van de RVV gezuiverd van plaques in ons laboratorium. (A) A cel cultuur plaat geënt met rotavirus bij 4 ° C voor de remming van de invasie van het virus in de cellen is geïncubeerd. Na incubatie en verwijderen van de niet-afhankelijke virale deeltjes naar cellen, het aantal genomen die afkomstig zijn van afhankelijke virale deeltjes naar het celoppervlak met RT-qPCR te kwantificeren. (B) het resultaat van de cel-binding assay werd weergegeven als bindend rendement (%), die de verhouding tussen de afhankelijke virale deeltjes naar de aanwezigen in de entmateriaal was. Vet bar: mediaan, einde van de vakken: kwartiel afwijking, einde van de lijn: maximum en minimum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Ons protocol voor het meten van de specifieke groeisnelheid is makkelijker dan de voorgaande en kan worden aangepast voor andere virussen tenzij hun celcultuur is nog niet vastgesteld. In deze studie, gebruikten we RVV (G3P[3]) omdat deze spanning plaquettes gemakkelijker dan menselijke Rotavirus vormen kan bij het gebruik van MA104 cellijnen. Sommige stammen van menselijke rotavirus kunnen niet plaque in deze cellijn vormen. Dus, in plaats van de plaque assay, de focus vormen van de eenheid (FFU) assay¹⁵ of mediaan weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) bepaling kan worden toegepast voor vele rotavirus stammen¹⁶. De gepresenteerde protocol voor het bepalen van de specifieke groeisnelheid kan worden gebruikt voor andere typen virus maar is niet geschikt voor virussen waarvoor geen gevestigde celcultuur wordt vastgesteld. Voordat u begint het experiment voor de specifieke groeisnelheid, het is beter om te weten van tevoren wanneer het besmettelijke virus-titer begint te verhogen en bereikt de stationaire fase in een oriënterende proef. Als teveel plaques aanwezig zijn, dienen de plaque assay weer na het wijzigen van het tarief van de verdunning van de virus-monsters worden uitgevoerd. De uren na infectie (hpi) monsters te verzamelen zijn ook belangrijk, omdat de helling van de exponentiële groeifase kan worden onderschat als het juiste tijdstip te bereiken van de stationaire fase is gemist. In de onderlinge aanpassing van de gemodificeerde Gompertz model, moet een coëfficiënt altijd worden berekend en gecontroleerd. Als de geschiktheid om de gewijzigde Gompertz model laag is, is er mogelijk andere groei-modellen zoals de gemodificeerde logistieke model¹² beter.

Bij de behandeling van cellen, bij het verwijderen van het medium of virus entmateriaal, de PBS voor wassen of agarose gel voor plaque assay moet onmiddellijk worden toegevoegd aan elk goed voor een cel cultuur plaat om te voorkomen dat de cellen van droogte. Op hetzelfde moment, moet je voorzichtig giet PBS of agarose naar cellen niet loskoppelen van putten. Deze stap is het meest belangrijk in beide tests (stap 3.9 en 3.11). Als de plaque bepaling te veel monsters heeft, raden we de agarose gel (100 mL elke maximale is aanbevolen) controledoeleinden in enkele middelgrote flessen en warm houden van de flessen, tot vlak voor gebruik sinds agarose gel is gestold binnen ongeveer 10 minuten op kamer temperatuur. Aangezien trypsine kwetsbaar voor hoge temperaturen^{17 is}, moet een trypsine oplossing worden toegevoegd aan een medium en agarose voor de plaque assay na voldoende afkoeling.

In de cel-bindende bepaling, moet de broedtijd virus binding aan cellen gebeuren bij 4 ° C om te voorkomen dat de invasie van de cellen. Volgens de Gilling methode¹³zijn cellen gevoelig voor droging bij lage temperaturen, dus zacht schudden noodzakelijk om 15 min tijdens de incubatie is. Het RNA extractie kit hier gebruikt kan worden vervangen voor andere kits. De helling van de standaard curve in RT-qPCR moet ongeveer 3.3, en de determinatiecoëfficiënt moet meer dan 0,98. Vergeleken met de fluorescentie Microscoop te visualiseren van de lokalisatie van virussen in cellen, is de bepaling sneller en eenvoudiger te gebruiken omdat de binding van fluorescerende stoffen aan virussen is niet nodig.

Onlangs, menselijke intestinale enteroid (HIE), vertonen een vergelijkbare cellulaire samenstelling en functie als menselijk gastro-intestinaal epitheel, beschikbaar voor rotavirus propagatie¹⁸is geworden. Het gebruik van HIE kan ons in staat stellen om de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van niet-culturable stammen van rotavirus te evalueren. Ook kunnen beide experimenten die hier beschreven worden toegepast op de evaluatie van de effecten van de drug op beide fenotypen¹⁹. De hier gepresenteerde protocollen kunnen kwantitatief bespreken de veranderingen in fenotype parameterwaarden van rotavirus stammen onder uiteenlopende omstandigheden.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door “The sanitaire voorzieningen waarde keten: ontwerpen van sanitaire systemen als Eco-communautaire waarde System” Project, onderzoeksinstituten voor de mensheid en de natuur (RIHN, Project No.14200107).

Materials

7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	Plaque assay
Disodium Hydrogenphosphate	Wako Pure Chemical Corporation	194-02875	Cell binding assay
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05900	Cell culture
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05901	Plaque assay
EasYFlask 75 cm2	Thermo Scientific	156499	Cell culture
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions	Gibco	10437028	Cell culture and Plaque assay
Forward / Reverse primers	Eurofins Genomics		qPCR
L-Glutamine, 200 mM Solution	Gibco	2530081	Cell culture and Plaque assay
Neutral Red	Wako Pure Chemical Corporation	140-00932	Plaque assay
PBS (-) "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05913	Cell culture and Plaque assay
Penicillin-Streptomycin, Liguid	Gibco	15140122	Cell culture and Plaque assay
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	Cell binding assay
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR039A	qPCR
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR037A	cDNA synthesis
PrimeTime qPCR Probes	Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Viral RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	RNA extraction
Sodium Bicarbonate	Wako Pure Chemical Corporation	199-05985	Cell culture and Plaque assay
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	198-01675	Cell binding assay
Tissue culture plates 24-well plate	TPP	92024	Cell binding assay
Tissue culture plates 6-well plate	TPP	92006	Plaque assay
Trizma base	SIGMA-ALDRICH	T1503	Cell binding assay
Trypsin from porcine pancrease	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	Activate for rotavirus
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red	Gibco	25300054	Cell culture
Vertical 96-Well Thermal Cycler	Applied Biosystems		cDNA synthesis

References

Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants?. Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (143), e58821, doi:10.3791/58821 (2019).