Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Syun-suke Kadoya; Daisuke Sano

doi:10.3791/58821

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunologie et infection

فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

Published: January 28, 2019

doi:

10.3791/58821

Syun-suke Kadoya¹, Daisuke Sano^1,2

¹Department of Civil and Environmental Engineering,Tohoku University, ²Department of Frontier Science for Advanced Environment, Graduate School of Environmental Studies,Tohoku University

Summary

نقدم هنا بروتوكولات اثنين، أحدهما لقياس معدل نمو محددة وأخرى للقدرة الملزمة الخلية من فيروس الروتا باستخدام مقايسة البلاك و RT qPCR. وتتوفر هذه البروتوكولات لتأكيد الفروق في تعمل بين سلالات فيروس الروتا.

Abstract

فيروس الروتا هو العامل الرئيسي الذي المسببة للإسهال عند الأطفال. فيروس الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (ds) ويشكل سكان متنوعة وراثيا، المعروفة باسم كواسيسبيسيس، نظراً لمعدل الطفرات عالية. هنا، نحن تصف كيفية قياس معدل نمو محددة وقدرة الخلية ملزم فيروس الروتا كما تعمل به. فيروس الروتا هو تعامل مع التربسين الاعتراف بمستقبلات الخلية وتلقيح ثم في ثقافة الخلية MA104. يتم جمع المادة طافية، بما في ذلك نسلها الفيروسية، بشكل متقطع. والرزن البلاك يستخدم لتأكيد عيار الفيروس (وحدة تشكيل اللوحة: بفو) لكل المادة التي تم جمعها طافية. يقدر معدل نمو محددة باحتواء البيانات الوقت بالطبع بفو/مل إلى نموذج جومبيرتز المعدلة. في المقايسة للخلية ملزم، مصاب بفيروس الروتا الخلايا MA104 في صفيحة 24-جيدا والمحتضنة لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية لفيروس الروتا الامتزاز بمستقبلات الخلية. درجة حرارة منخفضة يقيد فيروس الروتا من غزو الخلية المضيفة. بعد الغسيل لإزالة فيريونس غير منضمة، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من فيريونس يعلق على مستقبلات الخلية التي تليها كدنا التوليفي وعكس النسخ PCR الكمي (RT-qPCR). ويمكن تطبيق هذه البروتوكولات للتحقيق الاختلافات المظهرية بين سلالات فيروسية.

Introduction

فيروسات الرنا تشكل سكان متنوعة وراثيا، يعرف باسم كواسيسبيسيس¹، بسبب معدل الطفرات،² وأعلى من الكائنات الحية على أساس الحمض النووي. هيكل السكان في كواسيسبيسيس يتأثر بالعوامل الوراثية السكان، بما في ذلك الطفرة وضغط الانتخاب والانجراف الجينية. قد تظهر سلالات داخل نسب وراثية واحدة تعمل مختلف بسبب التنوع الوراثي. على سبيل المثال، أظهرت رشمدي et al. أن حساسية الكلور الحرة مختلفة بين سلالات نوروفيروس موريني التي نشأت من سلالة تنقية البلاك S7-PP3³.

روتافيروسيس (جنس فيروس الروتا في أسرة ريوفيريداي) هي الفيروسات غير المغلفة س رنا تشكيل كواسيسبيسيس². علاوة على العوامل الوراثية السكان المذكورة أعلاه، إعادة تشكيل جينوم الفيروس يؤثر على التنوع الجيني لفيروس الروتا لأن هذا الفيروس قد جينومات مجزأة 11⁴. روتافيروسيس يسبب الإسهال أساسا بين الأطفال الرضع، ووفيات الرضع في عام 2013 وقدرت حول 250,000⁵. لقاحين قيد الاستخدام في العديد من البلدان، وقد أثبتت فعاليتها في الحد من عبء الإصابة بفيروس الروتا، ولكن بعض الباحثين الآن نناقش وجود لقاح-الهروب طفرات⁶^،^،من⁷⁸^، ⁹-توصيف هذه طفرات من المهم فهم آليات لقاح-الهروب.

نقدم هنا، بروتوكولات لفحوصات اثنين لتقييم معدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا بغية فهم الاختلافات المظهرية بين سلالات/طفرات. منحنى النمو روتافيروسيس قد قدمت في السابق تقارير¹⁰، ولكن نمو المعلمات مثل معدل النمو المحددة لا تقاس عادة. ويشمل الإنزيم الخلية ملزم أجرى سابقا تقنية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت¹¹. نعرض هنا طرق أسهل من استخدام مقايسة البلاك و RT-قبكر، الذي يسمح لنا بمناقشة الفرق في تعمل الفيروسية كمياً. هذه الأساليب المناسبة لتوصيف تعمل فيروس الروتا، وأخيراً قد تسهم في تشييد لقاحات جديدة فعالة للأنماط الجينية متعددة.

Protocol

1-إعداد متوسطة لجعل خلية ثقافة متوسطة (المتوسطة المحتوية على مصل)، إضافة 4.7 غرام مسحوق MEM النسر إلى 500 مل ماء المقطر. اﻷوتوكﻻف عند 120 درجة مئوية 20 دقيقة واسمحوا بارد متوسط درجة حرارة الغرفة. إضافة مصل بقرى الجنين (تركيز النهائية: 10 ٪)، لام الجلوتامين (2 مم) والبنسلين والستربتوميسين (1 في المائة) وبيكربونات الصوديوم (1.125 غرام/لتر). تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. إعداد متوسطة خالية من المصل لنشر الفيروسات كما هو موضح في الخطوة 1، 1، ولكن دون المصل البقري الجنين. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من MEM المتوسطة النسر (غير المحتوية على الفينول الأحمر) قبل التعقيم. اسمحوا المتوسط تبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم قم بإضافة 2% FBS، 2% “البنسلين والستربتوميسين”، 4 مم الجلوتامين لام و 2.25 غرام/لتر ناكو3. مخزن في 4 درجات مئوية. لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من 2.5% [اغروس] هلام من اﻷوتوكﻻف. تحضير الجل في اليوم نفسه ويجري فحص اللوحة. تخزين الهلام في 47 درجة مئوية في حمام مائي. 2-خلية ثقافة قم بإزالة كريوتوبي التي تحتوي على خطوط الخلايا MA104 من حاوية نيتروجين سائل. وضع في كريوتوبي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لإذابة الجليد في الخلايا. أضف 1 مل تعليق خلية إلى 20 مل المتوسطة المحتوية على مصل في قارورة T75. احتضان قارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 2 أو 3 أيام.ملاحظة: أن تركيز الخلية الأخيرة في التعليق حوالي 106 خلايا/مل. مرة واحدة أحادي الطبقة الخلية يصل إلى 80% كونفلوينسي، إزالة المادة طافية وغسل الخلايا مرتين مع 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني في دولبيكو (الفوسفات مخزنة المالحة). إضافة 4 مل من 0.05% التربسين-يدتا قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من قارورة. نقل تعليق خلية الأنبوبة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 190 x ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف (106 خلايا) في 1 مل المحتوية على مصل 1.1 المعدة في المتوسط. تمييع الخلايا ريسوسبينديد في معززات مع المتوسط. أضف 3 مل تعليق خلية المخفف لكل بئر 6-جيدا (مقايسة البلاك) أو لوحات 24-جيدا (مقايسة ملزمة خلية)، على التوالي. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار مشبعة لمدة 2 أو 3 أيام.ملاحظة: قارورة T75 مناسبة لجمع العينات الوقت بالطبع لأنه يمكن تجاهل حجم عينة من المادة طافية (1 مل) مقارنة بإجمالي حجم طافية (30 مل). وفي الوقت نفسه، يقاس عيار المعدية الفيروس في كل المادة طافية بمقايسة اللوحة، التي تتم عادة باستخدام لوحة 6-جيدا. يستخدم لوحة 24-جيدا للمقايسة ملزمة خلية. 3-معدل النمو محدد من فيروس الروتا ملاحظة: فيروس الروتا الريسوسي (RRV، النمط الوراثي: G3P[3]) ويستخدم في هذا البروتوكول لأنه RRV يمكنك بسرعة وسهولة تشكيل لويحات مع الخلايا MA104. مكان أنبوب يحتوي على 1 مل تعليق الفيروس (بفو7 10/مل) في متوسط خالية من مصل الدم المخزنة في-80 درجة مئوية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة. احتضان تعليق الفيروس في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار مشبعة لمدة 30 دقيقة.ملاحظة: يمكن استخدام التربسين من المصادر الأخرى، ولكن أثر على العدوى فيروس الروتا بحاجة إلى اختبار مقدما. تمييع تعليق تنشيط الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط تعدد العدوى (وزارة الداخلية) إلى 0.1 بفو/خلية. إضافة 1 مل تعليق الفيروس المخفف لخطوط الخلايا MA104 (80% روافد) في قارورة T75 3 أيام بعد خلية الطلاء (2.1) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1، وتهز بلطف قارورة كل 15 دقيقة. ثم إضافة 30 مل وسيلة خالية من المصل تتضمن 0.13 ميكروغرام/مل من التربسين من بنكرياس الخنزير إلى قارورة. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة. جمع 1 مل من المادة طافية في قارورة على 0، 6، 12، 18، 24، و 36 (و/أو 48) ح العدوى بعد (hpi) واستبدال المادة طافية في أنابيب 1.5 مل باستخدام ماصة. إجراء التجميد (-80 درجة مئوية) وتذوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية دورة ثلاث مرات. ثم الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,600 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية. تصفية المادة طافية مع عامل تصفية مقطر 0.2 ميكرون لإزالة الكسر الخلية. تخزين في-80 درجة مئوية طافية في الثلاجة حتى تطبيقه على مقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس. وضع الأنابيب التي تحتوي على المادة التي تم جمعها (الخطوة 3، 5) طافية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين 1 مل عينة المخففة إذ واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء الاحتضان 30 دقيقة في 3.8، يغسل المقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس التي تم الحصول عليها من عينات بالطبع الوقت (الخطوة 3، 5)، أن تبدأ الخلايا MA104 مرتين في صفيحة 6-جيدا مع 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني بعد إزالة المتوسطة المحتوية على مصل. متسلسل تمييع العينات المحتضنة مع وسيلة خالية من المصل وتطعيم 1 مل العينة المخففة في كل بئر. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة، وتهز بلطف لوحة كل 15 دقيقة. بعد الحضانة، إزالة العدوى من لوحة 6-جيدا. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين إلى المتوسطة أعدت في (الخطوة 1، 3). بلطف ولكن فورا أضف 3 مل متوسطة مختلطة مع [اغروس] هلام (النسبة هي 1:1) لكل بئر. تبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقائق (حتى يصبح [اغروس] هلام الصلبة) واحتضانها لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة.ملاحظة: من أجل المتوسط مختلطة مع أجار من حافة البئر. أضف 1 مل من محلول الأحمر محايدة في 0.015% المخفف ببرنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة. إزالة الصبغة بعد ح 3 واحتضان لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية و 5% CO2 تحت البخار المشبعة. في اليوم التالي، عدد من اللوحات في كل بئر وحساب بفو/مل. فحص دقيق لالتقاء الخلية قبل مقايسة اللوحة لضمان إعداد اللوحة. 4-الخلية ملزم بالانزيم ملاحظة: ويستند هذا البروتوكول جيلينج للتقرير13. إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة (بنفس الطريقة كما هو الحال في 2.1). تمييع تعليق الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط وزارة الداخلية 1 بفو/خلية. يغسل خلايا MA104 مرتين على لوحة 24-جيدا مع 1 مل من المحلول الملحي مخزنة تريس (TBS؛ وقاعدة 2.53 غرام/لتر تريس، 6.54 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 0.3 غرام/لتر بوكل، 0.046 غرام/لتر Na2هبو4 إلى 1 لتر بالماء المقطر). تلقيح 100 ميليلتر لوقف الفيروس المخفف لكل بئر من صفيحة 24-جيدا مع الخلايا، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، مع لطيف تهز كل 15 دقيقة. إزالة العدوى الفيروس وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من tbs. لاستخراج المزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي لفيروس الروتا، إضافة ميليلتر 140 1 × برنامج تلفزيوني و 560 ميليلتر من المخزن المؤقت استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد) لكل بئر. يخلط على نحو كاف ماصة (حول 10 x أو حتى لا ينظر إلى الضباب أو الملوث من الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت). بعد استرداد رنا تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، ضع أنابيب 1.5 مل المحتوية على استخراج دسرنا على كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتجريدها دسرنا، ثم فورا وضع الأنابيب على الجليد واحتضانها لأكثر من 2 دقيقة. توليف كدنا باستخدام نسخ عكسي كيت (انظر الجدول للمواد). إضافة 4 ميليلتر من التشويه والتحريف حل الجيش الملكي النيبالي الفيروسية PCR أنبوب يحتوي على 16 ميليلتر من خليط (الجدول 1) ومزجها بعناية مع ماصة حتى لا يؤدي إلى توليد فقاعات. تدور إلى أسفل الأنابيب. إجراء النسخ العكسي مع cycler حرارية بشرط هو مبين في الجدول 2. إذا لم يتم استخدام كدنا الفور، تخزين أنابيب PCR تتضمن كدنا في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. استخدام في كبسولة تفجير ل PCR الكمي (الأمام-أككاتكتاكاكاتجاكككتك 5 ‘-3’، عكس؛ 5 ‘-جتكاكاتاكجكككك-3’)14 وتحقيق تقضي إدراج (qPCR المسابير؛ 5 ‘-/الاتحاد الماليزي/أتجاجكاكا/يحتوي/أتاجتاااجكتاكاكتجتكا/طمره-3’)، واستهداف 963-1049 المنطقة NSP3 الجينوم الجزء من فيروس الروتا (سلالة ST3، بنك الجينات: X81436).ملاحظة: يتم إدراج تقضي في التحقيق الذي صممه تسنغ et al.14 تمييع بلازميد القياسية متسلسل (10 من1 إلى 106 نسخ/مل) مع بكر الصف الماء إلى خليط قبكر (الجدول 3) وجعل مزيج الرئيسي (20 ميليلتر في عينة) qPCR عقب الجدول 4. إضافة 20 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى البئر لصفيحة بكر 96-جيدا، وثم 5 ميليلتر من عينات كدنا أو 5 ميليلتر من بلازميد القياسية مزيج من بيبيتينج 10 مرات. بدء رد فعل النظام qPCR وفقا للشروط المبينة في الجدول 4. لحساب جينوم فيروس الروتا منضمة إلى سطح الخلية MA104، إجراء الانحدار الخطي بين القيم المقطعية وعدد الجينوم المعروفة بلازميد القياسية، وتقدير عدد الجينوم العينة. ثم حساب نسبة virion أرقام ملزمة للخلايا (Gt) لتلك العدوى الأولية (ز0).

Representative Results

لمحة عامة عن بروتوكولين لمعدل نمو محددة وملزمة خلية التحليل البلاك-تنقية سلالات RRV هو هو موضح في الشكل 1A و 2A، على التوالي. المقايسة لمعدل نمو محددة، عيار الفيروس نهائي يبلغ أكثر من 107 بفو/مل عند نشر في قارورة T75. إذا كان تركيز أقصى أقل من 107 بفو/mL، لا قد تصبح الخلية MA104 المتلاقية أو لم يتم تنشيط RRV جيدا من قبل التربسين. وتتوفر بعض نماذج النمو لتقدير معدل النمو المحددة باستخدام البيانات وحدة المعدية. يعمل نموذج جومبيرتز معدلة12 هذا البروتوكول، على سبيل مثال؛ حيث ن0 (104 بفو/مل في هذه الدراسة) و Nt (104 إلى 108 بفو/mL) هي عيار الفيروسات المعدية (بفو/mL) في 0 و t (مثال: 0, 6، 12، 18، 24، 36) hpi، على التوالي، هو قيمة مقارب [سجل (N∞/N0 )] (مثال: 3 إلى 4)، μ هو معدل نمو محددة [1/ح]، (ه) هو ثابت نابير و λ هي فترة تأخر [ح]. يتم الحصول على نموذج معلمات بواسطة الدالة solver برمجيات التحليل، مما يقلل من مجموع المربعات للفرق بين القيم الملاحظة وعلى غرار. في المثال في الشكل 1B، يقدر معدل نمو محددة (μ) 0.197 [1/ح] والفترة الفاصلة (λ) هو 6.61 [ح] بتطبيق الأسلوب الأقل مربع نموذج جومبيرتز معدلة، وعيار الفيروس النسبي في مرحلة ثابتة إلى (عيار الأولية تسجيل نطاق) (A) هو 3.15 [سجل (N∞/N0)]. اختبرناها 6 استنساخ فيروس الروتا في المجموع، وتراوحت القيم المقدرة لمعدل نمو محددة 0.19 0.27 [1/h]. هذه المقدرة قيم موثوق بها لأن معامل تحديد القيم في تركيب نموذج أكثر من 0.98. فيريونس RRV ملزمة على أسطح الخلية كانت حوالي 103 نسخ/مل (ملزمة الكفاءة كان حوالي 1 في المائة) عند استخدام لوحة 24-جيدا مقايسة ربط الخلية (الشكل 2). الفحص يجري عادة ثلاث مرات لكل عينة، وإذا لوحظ تباين كبير في عدد النسخ في عينة، قد تحدث بعض المشاكل مثل التنشيط الغسيل المفرط وغير كافية من RRV بواسطة التربسين. قيمة Ct qPCR تتجاوز حوالي 36.0 ليست الأفضل، ويعتبر أن يكون أقل من حد كشف في حالتنا qPCR. الحجم/1 رد فعل 5 × بريميسكريبت المخزن المؤقت ميليلتر 4.0 إنزيم بريميسكريبت RT مزيج أنا ميليلتر 1.0 اليغو dT التمهيدي ميليلتر 1.0 الصرف 6 عشوائي ميليلتر 4.0 المياه المقطرة ميليلتر 6.0 عينة سرنا ميليلتر 4.0 المجموع ميليلتر 20.0 الجدول 1: ماجستير مزيج التكوين لتوليف كدنا لجينوم فيروس الروتا. درجة حرارة [درجة مئوية] الوقت 37 مدة 15 دقيقة 42 مدة 15 دقيقة 85 5 s 4 ∞ الجدول 2: رد فعل الشرط لتوليف كدنا جينوم فيروس الروتا. رد فعل حجم/1 بوليميراز بريمكس ميليلتر 12.5 التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرون) 0.5 ميليلتر عكس التمهيدي (10 ميكرون) 0.5 ميليلتر مسبار (10 ميكرون) 0.5 ميليلتر صبغ المرجع الثاني 0.5 ميليلتر المياه المقطرة 5.5 ميليلتر عينة كدنا ميليلتر 5.0 المجموع 25 ميليلتر الجدول 3: ماجستير مزيج تكوين PCR الكمي لفيروس الروتا جينوم. درجة حرارة [درجة مئوية] الوقت 95 5 دقيقة 94 20 s دورة 45 60 1 دقيقة 72 5 دقيقة الجدول 4: رد فعل شرط للكمي PCR لفيروس الروتا جينوم. رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لتقدير نمو فيروس الروتا ومنحني نمو فيروس الروتا. (أ) وحدة المعدية لفيروس الروتا يقاس بمقايسة اللوحة. (ب) المنحنى (الخط الأزرق) تم تقريبها بالطراز جومبيرتز المعدلة استناداً إلى بيانات الملاحظة في المختبر (دائرة بيضاء). معدل نمو محددة [μ]؛ 0.197 [h-1]، متخلفة عن الفترة (λ)؛ 6.61 [ح]، عيار الفيروس النسبي في المرحلة ثابتة لعيار الأولية (مقياس لوغاريتمي) (أ)؛ 3.15 [سجل (N∞/N0)]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: نظرة عامة التخطيطي والممثل نتيجة الفحص ملزمة خلية خمس سلالات RRV تنقيته من لويحات في المختبر. (A) A لوحة الثقافة الخلية تلقيح مع فيروس الروتا هو المحتضنة عند 4 درجة مئوية لمنع غزو الفيروس داخل الخلايا. بعد الاحتضان وإزالة الجسيمات الفيروسية غير منضم إلى الخلايا، تقدير عدد مورثات الناشئة من الجسيمات الفيروسية منضم إلى سطح الخلية مع الرايت qPCR. تم عرض المقايسة (ب) نتيجة للخلية-الربط كربط كفاءة (%)، والتي كانت نسبة الجزيئات الفيروسية المنضم للحاضرين في العدوى. شريط غامق: متوسط، نهاية مربعات: الانحراف الربعي، في نهاية السطر: الحد الأقصى والحد الأدنى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

لدينا بروتوكول لقياس معدل نمو محدد أسهل من سابقيه، ويمكن تكييفها لفيروسات أخرى إلا إذا لم ينشأ حتى الآن على نظام الثقافة الخلية. في هذه الدراسة، كنا RRV (G3P[3]) لأن هذا التوتر يمكن أن تشكل لويحات أسهل من روتافيروسيس البشرية عند استخدام خطوط الخلايا MA104. لا يمكن أن تشكل بعض سلالات فيروس الروتا البشري اللوحة في هذا خط الخلية. ولذلك، بدلاً من فحص اللوحة، التركيز تشكيل وحدة (فو) مقايسة¹⁵ أو متوسط زراعة الأنسجة المعدية جرعة (TCID50) الإنزيم يمكن تطبيقها للعديد من سلالات فيروس الروتا¹⁶. البروتوكول المقدم لتحديد معدل نمو محددة يمكن استخدامها لأنواع الفيروسات الأخرى ولكن ليست مناسبة للبحث عن الفيروسات التي أنشئت من أجلها أي نظام الثقافة الخلية المحددة. قبل البدء بالتجربة بالنسبة لمعدل نمو محددة، وهو أفضل لمعرفة مسبقاً عند بدء تشغيل عيار المعدية الفيروس زيادة وتصل إلى مرحلة ثابتة في اختبار أولى. في حالة وجود لويحات كثيرة جداً، ينبغي أن تجري المقايسة اللوحة مرة أخرى بعد تغيير معدل تخفيف عينات الفيروس. ساعات ما بعد العدوى (hpi) لجمع العينات أيضا هامة لمنحدر مرحلة النمو المتسارع قد يمكن التقليل من شأن إذا غاب عن نقطة الوقت المناسب للوصول إلى مرحلة ثابتة. في تقريب نموذج جومبيرتز المعدلة، ينبغي دائماً تحسب معامل التحديد والتحقق. إذا كانت اللياقة البدنية لنموذج جومبيرتز معدلة منخفضة، قد يكون من الأفضل نماذج النمو الأخرى مثل النموذج اللوجستي معدلة¹² .

في التعامل مع الخلايا، عند إزالة العدوى المتوسطة أو الفيروسات، برنامج تلفزيوني للغسيل أو [اغروس] هلام للمقايسة البلاك يجب على الفور إضافة إلى كل جيد من لوحة الثقافة الخلية لمنع الخلايا من جفاف. في الوقت نفسه، يجب صب برنامج تلفزيوني أو [اغروس] للخلايا بعدم فصل من الآبار بلطف. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية في كلا فحوصات (الخطوة 3.9 و 3.11). إذا كان التحليل البلاك عينات كثيرة جداً، نوصي بتقسيم [اغروس] هلام (100 مل كل الحد الأقصى المستحسن) إلى عدة زجاجات متوسطة وحفظ الزجاجات الحارة حتى قبل استخدام منذ [اغروس] هلام هو توطد داخل حوالي 10 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. منذ التربسين معرضة لدرجات حرارة عالية¹⁷، ينبغي إضافة حل التربسين إلى متوسطة و [اغروس] للمقايسة البلاك بعد تهدئة كافية.

يجب أن يتم في الحضانة ملزم الفيروس إلى الخلايا في مقايسة خلية ملزمة، عند 4 درجة مئوية لمنع غزو الخلايا. وفقا للأسلوب الذي جيلينج¹³، الخلايا المعرضة للتجفيف عند درجات حرارة منخفضة، حيث تهز لطيف ضروري كل 15 دقيقة أثناء الحضانة. أدوات استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة هنا يمكن أن تكون بديلاً لمجموعات أخرى. منحدر المنحنى المعياري في الرايت قبكر ينبغي أن يكون حوالي 3.3، ومعامل التحديد ينبغي أن يكون أكثر من 0.98. مقارنة بالمجهر الأسفار تصور تعريب الفيروسات في الخلايا، التحليل أسرع وأسهل في الاستخدام لأنه ليس من الضروري ربط المواد الفلورية للفيروسات أكثر.

في الآونة الأخيرة، انتيرويد المعوية البشرية (HIE)، نستعرض تكوين الخلوية مماثلة والدالة ظهارة المعدة والأمعاء البشرية، قد أصبحت متاحة ل نشر فيروس الروتا¹⁸. استخدام كامو قد تمكننا من تقييم معدل نمو محددة والقدرة الملزمة الخلية غير كولتورابل سلالات من فيروس الروتا. أيضا، قد طبقت كل التجارب الموضحة هنا لتقييم آثار المخدرات على حد سواء تعمل¹⁹. البروتوكولات المقدمة هنا تجعل من الممكن كمياً مناقشة التغييرات في قيم المعلمة النمط الظاهري من سلالات فيروس الروتا في ظروف متنوعة.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل “الصرف الصحي قيمة السلسلة: تصميم المرافق الصحية نظم الإيكولوجية والمجتمعات المحلية قيمة منظومة” المشروع، ريسيرتشينستيتوتي للإنسانية والطبيعة (رين، Project No.14200107).

Materials

7500 Real Time PCR System	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	Plaque assay
Disodium Hydrogenphosphate	Wako Pure Chemical Corporation	194-02875	Cell binding assay
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05900	Cell culture
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05901	Plaque assay
EasYFlask 75 cm2	Thermo Scientific	156499	Cell culture
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions	Gibco	10437028	Cell culture and Plaque assay
Forward / Reverse primers	Eurofins Genomics		qPCR
L-Glutamine, 200 mM Solution	Gibco	2530081	Cell culture and Plaque assay
Neutral Red	Wako Pure Chemical Corporation	140-00932	Plaque assay
PBS (-) "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05913	Cell culture and Plaque assay
Penicillin-Streptomycin, Liguid	Gibco	15140122	Cell culture and Plaque assay
Potassium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	Cell binding assay
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR039A	qPCR
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR037A	cDNA synthesis
PrimeTime qPCR Probes	Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Viral RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	RNA extraction
Sodium Bicarbonate	Wako Pure Chemical Corporation	199-05985	Cell culture and Plaque assay
Sodium Chloride	Wako Pure Chemical Corporation	198-01675	Cell binding assay
Tissue culture plates 24-well plate	TPP	92024	Cell binding assay
Tissue culture plates 6-well plate	TPP	92006	Plaque assay
Trizma base	SIGMA-ALDRICH	T1503	Cell binding assay
Trypsin from porcine pancrease	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	Activate for rotavirus
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red	Gibco	25300054	Cell culture
Vertical 96-Well Thermal Cycler	Applied Biosystems		cDNA synthesis

References

Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants?. Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology – B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (143), e58821, doi:10.3791/58821 (2019).