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Environnement

不同环境条件下生物气溶胶的组成及分布分析

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

了解环境颗粒物的生物组成对于研究其对人类健康和疾病传播的重大影响具有重要意义。在这里, 我们使用了三种类型的生物气溶胶采样方法和空气微生物的生物分析, 以更好地探索不同环境条件下的空气微生物群落。

Abstract

不同环境条件下颗粒物 (pm) 中的可变微生物可能对人体健康有显著影响。在本研究中, 我们描述了一种对环境 pm 中的生物成分进行多重分析的方案, 并进行了五个实验: (1) 利用激光粒子计数器进行 pm 数监测;(2) 利用旋回气溶胶采样器采集 pm;(3) 采用带过滤器的大容量空气采样器进行 pm 采集;(4) 安徒生六级取样器收集的可培养微生物;(5)细菌 16srdna和真菌its 区域测序检测环境 pm 的生物成分。我们选择了模糊的日子和牲畜养殖场作为该协议中应用程序的两个典型示例。本研究采用旋流气溶胶采样器和滤波器采样器两种采样方法, 显示出不同的采样效率。环氧气雾剂采样器在采集细菌方面表现要好得多, 而这两种方法在采集真菌方面表现出相同的效率。过滤器采样器可以在低温条件下工作, 而旋风气溶胶采样器对温度有采样限制。固体冲击采样器, 如安徒生六级取样器, 可用于直接将生物气溶胶采样到培养基中, 从而提高可培养微生物的存活率。然而, 这种方法主要依靠培养, 而99% 以上的微生物无法培养。采用细菌16s rdna 和真菌 its 区域测序法, 检测安徒生六级采样器采集的可培养细菌和旋风气溶胶采样器和过滤采样器采集的样品中提取的 dna. 上述方法在环境监测和空气中病原体检测等许多研究领域都有广泛的应用。从这些结果中, 我们可以得出结论, 这些方法可以在不同的条件下使用, 可以帮助其他研究人员进一步探讨环境生物气溶胶对健康的影响。

Introduction

在自然环境中, 生物气溶胶中存在着各种微生物, 包括真菌、细菌、病毒和其他微生物1。空气中的微生物可以从一些人类活动中排放出来, 如在牲畜养殖场的动物饲养作业, 是大气环境的重要内容2。这些微生物不仅可能在大气环境中发挥重要作用, 而且对人类健康和疾病传播也有重大影响。

微生物气溶胶作为一种重要的疾病传播方式, 在世界范围内引起了广泛的关注。在最近的研究中, 发现许多人类疾病与不同地点环境颗粒物 (pm) 的复杂成分有关, 如化工厂、牲畜养殖场和烟雾弥漫的城市3、4.pm 的生物成分可能导致一些呼吸道和心血管疾病在 pm 暴露的人5。不同的身体区域, 如粘膜、皮肤、消化道和呼吸道, 可能是附着在 pm6、7 上的微生物的潜在目标。长期接触 pm 2.5 8可能会增加患肺癌的风险。

在世界多个国家的不同地点, 包括地铁站、兽医医院、屠宰场、堆肥设施、制革厂、牛奶加工设施、煤矿、牙科诊所, 都对空气中的细菌进行了调查和室内环境9,10,11,12,13,14, 15, 16,17,产生一个大量关于生物气溶胶的报道。在朦胧的日子里, 与校园、牲畜养殖场和大城市相关的拥挤场所是三个特别重要的公共条件, 我们需要探讨人类健康与 pm 暴露的潜在影响之间的联系。此外, 在中国北方城市的冬季, 高 pm2.5值可能会影响人类健康。尽管 pm2.5 可以通过靶向呼吸表面并溶解到血液中产生毒性作用, 但目前仍不清楚与 pm2.5相连的微生物是否以及如何可能影响人类健康 19 ,20。畜禽养殖场是 pm 和空气中微生物气溶胶的主要来源之一。大量病原体, 如流感病毒和黑曲霉, 是由气溶胶在牲畜养殖场周围的田地中携带的, 是造成畜禽工人呼吸道疾病的重要因素。

在本研究中, 我们探讨了多种类型的生物气溶胶分析, 包括 pm 数监测, 生物气溶胶收集和生物成分分析。空气样本是由一个旋风气溶胶采样器, 一个大容量空气采样器与过滤器和安徒生六阶段采样器收集。然后, 通过细菌16s rdna 和真菌its测序等生物分析, 对这三个采样器采集的样品进行分析, 以确定其生物组成。在此, 我们展示了北京朦胧时期采集的生物气溶胶样本和牲畜养殖场的代表性结果, 表明生物气溶胶可能对人类和动物健康产生重大影响。本文主要根据 16s dna 和真菌 its 测序的数据, 探讨了液体采样方法与滤池采样方法的比较。

Protocol

1. pm 数字监控 使用机载激光粒子计数器 (参见材料表) 来确定总 pm 数。通过机载激光粒子计数器顶部的空气采样端口收集 pm。注: 此粒子计数器是一种自动化设备, 当程序 (包括采样时间、间隔、收集时间等) 已在其触摸屏上设置时, 它可以独立工作。 为仪器配备传感器, 以监测温度和相对湿度。每5分钟同时测量和记录一次温度和相对湿度数据。 总之, 每5分钟测量和记录6个不同的粒径类别 (0.3-0.5 微米、0.5-0.7μm、0.7-2.5 微米、2.5-5μm、5-10μm 和 > 10μm), 同时测量4个其他粒径类别 (0.3-0.5μm、0.5-1-1 微米、1-3 微米和≥3微米)。 通过采样器顶部的采样孔收集空气样本, 并使用采样器内的测试模块测量每个 pm 的粒径。然后自动存储数据。通过机载激光粒子计数器的微型触摸显示器设置相关参数 (包括采样时间和计数范围) 后, 可以自动执行上述所有过程。注: 此粒子计数器是一种自动化设备, 它具有计算不同粒度类的 pm 数的测试模块。 若要评估实验标准误差, 请确保至少有15次复制计算不同的粒径类别。确保读数存储在仪器的内部存储器中, 并随后进行分析。 确保对主要数据的分析包括 pm 数量浓度、方差分析测试和每个大小类中 pm 的百分比。例如,如图 110.2所示, 12月份的 pm 数量浓度 (237.6 厘米 3) 明显高于 10月份 (平均: 110.2 厘米 3) (方差分析;p 值 < 0.05)。图 1 b显示, 小于3微米的颗粒数量占总数量的99% 以上。 使用激光粒子计数器监视 pm 数量浓度并自动存储数据。使用 usb 闪存盘导出计算机中的数据并执行方差分析测试。 2. 旋流气溶胶采样器的 pm 收集 在离地面 ~ 2 米的空地上进行 pm 取样, 附近没有任何主要污染源。 记录采样站点的位置。例如, 北京理工大学的校区如下: 北纬 39°57 ‘ 51.0 ‘;东经 116°19 ‘ 38.5 ‘。 使用旋流气溶胶采样器收集空气样本。使用 323 l/min 的采样器流量, 收集时间为6小时。注: 采样器流量是固定的, 不能更改。收集时间由手动计时控制, 因为此采样器上只有一个”开始”和”停止” 按钮。 在收集前, 使用无菌水清洗旋流气溶胶采样器内部 3次, 并通过连续按下收集按钮 3次, 使用自动清洗功能3次。 按下收集按钮开始采样, 然后按泵按钮停止采样。将取样器放在架子上或地板上, 没有人将取样器固定在适当的位置。 将所有样品保存在-20°c 的黑暗中, 直到随后的分析。 3. 按筛选器进行 pm 集合 在离地面 ~ 2 米的空地上进行 pm 取样, 附近没有任何主要污染源。 记录采样站点的位置。例如, 北京理工大学的校区如下: 北纬 39°57 ‘ 51.0 ‘;东经 116°19 ‘ 38.5 ‘。 利用流量为 1, 000 l/min的大容量空气采样器 (见材料表), 在 20.32×25.4 cm 2 过滤器 (见材料表) 上采集 pm 样品, 通过相对自动编程确定流量和收集时间。 将所有采样滤清器保存在-20°c 的黑暗中, 直到随后进行分析。 4. 生物成分分析 对于生物成分分析, 请根据制造商的协议, 使用旋流气溶胶采样器或滤镜中的每个液体样本, 通过多源 dna 提取试剂盒 (见材料表) 提取 dna。 对于带有过滤器的大容量空气采样器中的样品, 请使用每个滤镜样本中的一半进行 dna 提取。将滤清器放入50毫升管中, 样品朝内, 背面朝管壁。在中央站点中, 向包含样品的滤清器一侧添加10个珠子。 在室温下将管旋涡15分钟。将液体输送到管内50毫升的离心管中, 继续 dna 提取过程。 通过以下过程从样本中提取 dna。 以 2, 000 x 克的速度离心细菌样本 5分钟, 去除上清液, 并在2毫升的无菌 pbs 缓冲液中悬浮细菌。 收集细菌悬浮在2毫升离心管中, 然后以 2, 000 x g 离心 5分钟, 丢弃上清液。 在溶液中加入350μl 含有悬浮细菌的无菌 pbs 缓冲液。 加入 0.8 ml 的 rnase a。 加入150μl 的缓冲 cl 和8μl 的蛋白酶 k, 并通过涡流晃动立即混合1分钟。在 1, 000 x 克的温度下短暂离心 30秒 (墙上没有残留物) 后, 将离心管放入56°c 的水中10分钟。 加入350μl 的缓冲 pd, 混合 30秒, 然后离心 10分钟, 12, 000 x 克。 将 dna 制备管放入2毫升离心管中, 并将步进制成的混合物4.2.6 转移到制备管中。然后离心 1分钟, 12, 000 x 克。 丢弃滤液, 将制备管的内容物放回原来的2毫升离心管中, 加入50μl 的缓冲 w1。以 12, 000 x g 的速度将混合物离心1分钟。 丢弃滤液, 将制备管的内容物放回原来的2毫升离心管中, 加入700μl 的缓冲 w2。以 12, 000 x g 的速度将混合物离心 1分钟, 重复此步骤, 再次用700μl 的缓冲 w2 清洗。 丢弃废液, 并将制备管的内容物放回原来的2毫升离心管中。以 12, 000 x g 的速度将混合物离心1分钟。 将 dna 制备管的内容物放入另一干净的 1.5 ml 离心管中, 并在制备管膜中间加入100μl 的洗脱液或去离子水 (去离子水或洗脱液加热到 65°c)。允许混合物在室温下站立 1分钟, 并以 12, 000 x 克离心混合物1分钟。 进行定量实时聚合酶链反应 (q-rt-pcr), 以量化采样过滤器上细菌和真菌的相对丰度。 使用引物如下: 细菌16s rdna、515f (5 ‘-ggg cca gcc gcg gta a-3 ‘) 和 806r (5 ‘-gga cta cta ggggg twg tt at-3 ‘);和真菌its, its1 (5 ‘-tcc gta ggt ggt gcg g-3 ‘) 和 its1 (5 ‘-gct gct tct tct atc atc gc-3 ‘)。 在实时 pcr 系统上运行 q-rt-pcr 检测 (参见材料表)。rt-pcr 条件: 退行性变前, 95°c, 10分钟;退化, 95°c, 15秒;退火和延长, 60°c, 1分钟;40个周期从退化到退火和延伸。 为了进行细菌和真菌群落结构分析, 通过 pcr扩增细菌 16s rdna 的V1–V3 区域和真菌 rrna 操作子的its区域。 使用引物如下: 对于细菌, v1-9f (5 ‘-cct atc ccc tgt gggcct tgg cg ct ct ct acg agt ttg atg atg mtg gct ct ct ct-3 ‘ 和 v3-541r (5 ‘-cca tct ccc ccc tgc tgc tct ccg act cg-法格-法线 ccw cta ctg ctg ctg g-3 ‘);和真菌, its-3f (5 ‘-cct atc ccc tgt tgg cct tgg cct ct cac atc atc gaa gaa gaa gaa agc-3 ‘) 和 its-4r (5 ‘-cca tct cc ccc ccc tgc tct ccg cg cg———————————————————————————————————— 确保 pcr 的20μl 混合物包括2μl 的 2.5 mm dntp、4μl 的5xfastpfu 缓冲、0.8μl 的每种引物 (5μm)、0.4μl 的 fastpfu 聚合酶和 10 ng 模板 dna (见材料表)。 使用 pcr 程序如下: 94°c 5分钟;其次是10次周期 94°c, 55-60°c 为 45秒, 72°c 循环为 90秒;20个90°c 循环 30秒, 55°c 循环 45秒, 72°c 循环 90°c;并在72°c 下最后一次延长5分钟。 执行 dna 纯化、dna 定量和焦磷酸测序, 如先前的研究21所述。 5. 生物气溶胶取样和培养 使用国际标准安徒生六级取样器 (见材料表) 以 28.3 l/min 的流速对可培养的空气中细菌和真菌进行采样. 使用35分钟的采样时间. 将培养板放入取样器的每个阶段。每次取样后, 用75% 的乙醇对取样器进行充分消毒。注: 采样器流量是固定的, 收集时间由手动计时控制。 用安徒生六级取样器来采样这六个阶段, 由空气颗粒的空气动力直径定义, 包括第六阶段 (0.65–1.1μm)、阶段 v (1.1–2.1 微米)、第四阶段 (2.1–3.3 微米)、第三阶段 (3.3-4.7 微米)、第二阶段 (4.7–7.0 微米) 和第一阶段(≥7.0 微米)。 收集细菌颗粒并沉积到含有大豆-酪蛋白消化琼脂的每个阶段的培养板上 (见材料表)。在取样器的每个阶段, 顶部都有一个容器, 上面有许多进气口。 在37°c 条件下培养空气中的细菌收集板 24-48;然后, 计算每个阶段样品盘上菌落的细菌数量。 为了防止安徒生六级取样器收集的粒子重叠, 请通过以下公式纠正每个采样器级别的菌落数:其中 pr: 纠正了每个级别的菌落数量,n: 各级采样器的采样孔数 (400), 以及r: 殖民地的实际计数。 计算每米3空气中菌落的单位, 如下所示:其中 c: 浓度 (cfusem 3),n1-n6: 每个级别的修正菌落数,t: 采样时间 (分钟), 以及f: 采样流量 (28.3 l/min)。 使用步骤 5.1-5.3 中的方法研究牲畜养殖场中的生物气溶胶, 包括四种类型的猪油。注: 畜禽养殖场位于中国长春。在每个猪场中, 离地面2米的中心位置被选定为取样地点。细菌培养后, 按照步骤 6.1-6.2 中的说明, 处理盘子中的所有菌落。 6. 可培养细菌的鉴定 培养48小时或72小时后, 将细菌放入2毫升离心管中。使用多源 dna 提取试剂盒提取这些细菌或真菌的 dna (见材料表)。dna 提取过程在第4.2 节中进行了描述。 使用 200μl dna 提取样本进行 16s rdna测序。使用关于生物成分分析的步骤4.2、4.3 和4.4 中所述的相同过程.

Representative Results

在这项研究中, 我们对9月至12月奶牛场的 pm 总体分布进行了评估, 并对其生物气溶胶进行了全面分析。许多环境因素导致了气溶胶颗粒的分布。利用 tsi 激光粒子计数器研究了牛舍 pm 的浓度和大小分布。如图 1a所示, 气雾剂颗粒的浓度在12月最高, 在10月最低, 这可能是由温度和湿度的变化引起的 (表 1)。可吸入气溶胶颗粒的浓度 (0.3-3.0 微米) 占总颗粒浓度的99% 以上 (图 1 b), 这一范围内的颗粒可到达深呼吸道, 对人类和人类造成严重危害。动物。 样品的生物成分分析可以通过 dna 提取、细菌16srsdna和真菌its 区域测序来代替微生物培养。通过对利用旋流气溶胶采样器或带过滤器的大容量空气采样器采集的生物气溶胶样品的生物学分析, 可以初步比较这两种方法在采集细菌和真菌方面的效率。图 2显示了2016年12月20日在北京理工大学校园收集的北京模糊日采集的生物气溶胶样本的分析结果。在细菌采集方面, 研究结果表明, 环氧气溶胶采样器采集的属比带过滤器的大容量空气采样器多很多 (图 2a)。对于真菌采集, 这些取样器显示出相同的收集效率和几乎相同的属丰度 (图 2b)。从图 2中给出的结果中, 我们能够测量这两种细菌和真菌方法的不同收集效率。在细菌收集方面, 环氧气雾剂采样器的表现远远好于带有过滤器的大容量空气采样器, 因为前者的样本显示出较高的属丰度 (图 2a)。然而, 对不同采样方法的两个样本进行的真菌测序分析显示了几乎相同的社区结构 (图 2b)。 我们使用安徒生六级取样器研究了空气中的可培养细菌。如图 3所示, 减少了 i-vi 期颗粒的可培养细菌的菌落数量。第一阶段颗粒 (粒径 > 8.2μm) 的可培养细菌菌落最多。在农家房、怀孕母猪房、养肥屋、断奶房等四种不同类型的猪舍中, i 期菌落的比例分别为33%、30%、26% 和34%。四种不同类型猪排的 ii 期菌落比例分别为20%、22%、19% 和20%。在四种不同类型的猪排中, iii 期菌落的比例分别为18%、18%、18% 和19%。四种不同类型猪排的第四期菌落比例分别为17%、16%、16% 和16%。四种不同类型猪排的 v 期菌落比例分别为10%、10%、14% 和6%。第六阶段颗粒 (粒径 < 1.0μm) 的可培养细菌菌落最少。四种不同类型猪排的 vi 期菌落比例分别为3%、5%、6% 和5%。 利用安徒生六级取样器在四种不同类型的猪油中采集空气样本, 然后在适当的条件下进行培养。通过细菌16s rdna 和真菌 its 区域测序, 提取并检测了从各个颗粒阶段采集的可培养细菌的全基因组 dna。在猪场中的可培养细菌中, 共发现了91属和158种细菌。图 4显示了从第一阶段到第六阶段的四种不同类型猪舍的可培养细菌群落结构, 包括产房、怀孕母猪屋、养肥屋和断奶屋。不同猪种中不同优势菌属的含量不同。 图 1: 四个不同月份 pm 的浓度和大小分布.(a) 研究期间 pm 号的 boxplot。每个框图包括数据库的最大值、最小值、中值、两个四分位数和异常值。(b) pm 的平均大小分布图。从 9月到12月, 房子里有80头奶牛。pm (≥3μm) 在四个月 (9月、10月、11月和 12月) 中的百分比分别为0.005、0.005、0.002 和0.002。请点击这里查看此图的较大版本. 图 2: 两个取样器采集的生物气溶胶样本的生物分析.(a) 和 (b) 显示以不同收集方法获得的生物气溶胶样本中细菌或真菌属的丰度。湿壁空气采样器代表旋风气溶胶采样器。石英滤清器代表带有过滤器的大容量空气采样器。请点击这里查看此图的较大版本. 图 3: 四种猪科可培养细菌的平均分层分布图.四种类型的猪舍是农家房、怀孕母猪屋、养肥屋和断奶屋。s1 至 s6 代表安徒生六阶段采样器收集的六个粒子级 (i 到 vi)。各阶段由空气颗粒的空气动力直径确定, 包括第六期 (0.65-1.1μm)、第五阶段 (1.1-2.1 微米)、第四阶段 (2.1-3.3 微米)、第三阶段 (3.3-4.7 微米)、第二阶段 (4.7-7.0 微米) 和第一阶段 (7.0 微米)。请点击这里查看此图的较大版本. 图 4: 空气样本中具有不同丰度的细菌群落结构.利用安徒生六级取样器在四种不同类型的猪油中采集空气样本, 然后在适当的条件下进行培养。采用细菌16s rdna 测序法提取并检测安徒生六级采样器采集的每个颗粒阶段可培养细菌的全基因组 dna。每种类型的猪场中的数字1到6代表安徒生六级取样器测量的粒子级 i 到 vi。右侧的文本包括每个细菌的属名称。请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

在这项研究中, 我们提供了一些具有代表性的结果, 在朦胧的日子和牲畜养殖场。在北京朦胧的日子里采集的生物气溶胶样本的结果有助于更好地了解北京模糊天没有 pm 的 pm 生物组成的生物组成。从畜禽养殖场采集的样本结果还将为猪场的环境空气质量控制提供基本数据, 并为畜禽养殖场的健康繁殖和安全生产提供理论基础和技术支持。许多环境因素, 如温度、湿度和风速, 可能会导致牛屋气溶胶颗粒的分布 (图 1)。以往的研究显示, 畜禽养殖场的 pm 主要来自饲料、粪便、毛皮和羽毛, 这可能与动物活动有关。环境因素不仅会影响动物活动, 还会影响相对封闭的牛舍 pm 的聚集和扩散。因此, 我们检测到不同的浓度和大小分布在四个不同的月份 pm。此外, 四种猪排的卫生条件、喂养方法和动物活性不同, 也可能影响其在空气中的可培养细菌群落结构 (图 4)。

然而, 在这项研究中, 我们主要研究了在不同环境条件下研究生物气溶胶成分和分布的现有方法。与其他微生物样品相比, 空气中微生物的微生物样品浓度很低, 并与无机灰尘颗粒等大量杂质混合, 在采集和检测过程中存在一定的困难。这样的微生物21。因此, 应选择适当的微生物气溶胶收集和检测方法。微生物气溶胶样品的采集一般采用沉淀法或专门设备, 收集液体、半固体或固体取样介质 22、23、24 中的微生物.然后, 进行了相应的技术处理和具体的检测和分析.取样介质应保持微生物的完整性, 以减少与检测和分析相关的误差26。然而, 不同的气溶胶微生物取样器由于其不同的采样原理和介质, 对样品的完整性有不同的影响。人们设计了多种生物气溶胶采样器, 使用不同的采样原理, 如惯性冲击、过滤阻力和静电沉淀27。

冲击采样器可以利用提取设备高速将机载 pm 推入采样介质。有两种类型的冲击采样器: 固体和液体。固体冲击取样器可用于低浓度的生物气溶胶样品, 几乎不受气流28的影响。可对不同大小的气溶胶颗粒进行初步筛选, 并可将微生物直接取样到培养基中, 提高可培养微生物的成活率 10.由于惯性冲击, 微生物气溶胶颗粒容易在同一地点发生碰撞, 培养后菌落容易重叠。目前, 最常见的固体冲击采样器是安徒生-6 微生物气溶胶采样器。在本研究中, 我们使用安徒生六阶段采样器研究了不同大小的空气中 pm 中分布的可培养细菌。

旋风气溶胶采样器使用旋风将高速空气螺旋成气缸或圆锥。生物气溶胶颗粒可以通过离心力从气流中分离出来, 这意味着微生物可以撞到采样器的内壁, 然后通过采样缓冲液收集。该方法方便, 可用于大流量和采样作业中的长采样时间。但是, 此方法不能在低温下实现, 因为操作依赖于液体。本研究中使用的旋风气溶胶采样器是一种旋风湿壁气溶胶采样器, 它可以从采样空气中提取并将空气中的病原体和颗粒转移到少量水中进行分析29。

滤清器采样器可以在低温条件下工作, 并且可以对超过一定尺寸的颗粒进行采样。然而, 它们对微生物活性有很大影响, 容易受到损害, 这将极大地影响随后对取样活动的研究。在这项研究中, 从北京模糊的日子生物气溶胶样本收集使用大容量空气采样器与过滤器和一个旋回气溶胶采样器。本实验的目的是在不对空气微生物进行分离培养的情况下, 对 pm 的生物组成进行分析。因此, 这两种抽样方法都适合于本研究。对于旋流气溶胶采样器法, 低浓度的空气微生物可以很容易地提取到运行中的缓冲液中, 然后可以方便地进行分析, 而无需进行常用的过滤样品额外处理。本研究采用旋流气溶胶采样器和滤波器采样器两种采样方法, 显示出不同的采样效率。通常用于筛选样品的附加处理 (如从筛选器中恢复样品) 是这两种方法的主要区别之一。此外, 利用循环气溶胶采样器将空气样本直接采集到运行缓冲器中, 而其他方法则在过滤器上采集样品。不同类型取样方法的特点可能有助于这种不同的取样效率。我们可以假设, 旋流气溶胶采样器是微生物采集的较好选择, 这一假设需要进一步验证。

本研究采用细菌16s rdna和真菌its区域测序技术对其进行生物气溶胶的生物分析。16srdna测序是在微生物基因组30中测定 16s rdna片段。16s rdna 广泛存在于具有较高保存性和特异性的原核生物中, 对微生物31种的鉴定具有一定的参考价值。全基因组测序只需要提取基因组 dna 并随后进行测序。除了产生大量数据外, 这一过程还可以对微生物群落结构进行更全面的分析。此外, 通过提供更多的信息, 元基因组学也可以在这一研究领域得到应用。handelsman等人在1998年一篇关于土壤32中微生物的论文中首次提出了元基因组的概念。在随后的研究中, 元基因组的概念逐渐被接受, 并对人类肠道、海洋和土壤中的微生物进行了 33、34、35 的大量研究。在高通量测序技术的支持下, 元基因组学发展迅速, 在病原体检测研究中发挥着越来越重要的作用。传统的微生物研究方法主要依靠培养进行分离和纯化。然而, 许多研究无法进行, 因为99% 以上的微生物无法培养。与传统方法不同的是, 元基因组学可以将整个环境中所有微生物的遗传信息获取, 而不需要分离个体生物 36.可以直接对由此产生的所有微生物进行全面分析。

总之, 本研究显示了几种可用于研究环境 pm 生物组成的检测、取样和分析方法, 包括 pm 监测;由安徒生六级采样器、带过滤器或旋风气溶胶采样器的大容量空气采样器进行 pm 采样;以及随后基于 dna 测序的生物分析。实际上, 这些方法可以在不同的环境条件下使用, 例如许多类型的牲畜养殖场。我们的协议和结果可能有助于世界各地的其他研究人员进一步探讨真菌和细菌生物气溶胶对环境的健康影响。

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究的财政支持来自国家自然科学基金 (41775148 号)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
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References

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Citer Cet Article
Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
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