Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Uylissa A. Rodriguez; Yaping Zeng; Margaret A. Parsley; Bridget E. Hawkins; Donald S. Prough; Douglas S. DeWitt

doi:10.3791/58792

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Neurosciences

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Published: April 01, 2019

doi:

10.3791/58792

Uylissa A. Rodriguez^1,2, Yaping Zeng^1,2, Margaret A. Parsley^1,2, Bridget E. Hawkins^1,2, Donald S. Prough^1,2, Douglas S. DeWitt^1,2

¹Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch, ²The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research,University of Texas Medical Branch

Summary

여기, 선물이 ex vivo 혈관 반응성 결정 다음 주 폭발 외상 성 뇌 손상 (bTBI) 절연, 가압, 설치류 중간 대뇌 동맥 (MCA) 세그먼트를 사용 하 여 위한 방법을 설명 하는 프로토콜. bTBI 유도 충격 관로 알려진 또한 고급 폭발 시뮬레이터 (ABS) 장치를 사용 하 여 수행 됩니다.

Abstract

폭발 노출의 histopathological와 행동 효력에 연구 되었습니다, 비록 적은 폭발의 대뇌 혈관 효과에 전념 했습니다. 영향 (즉,, 비-폭발) 외상 성 뇌 손상 (TBI) 감소 모두 인간과 실험 동물에서 대뇌 맥 관 구조에 압력 autoregulation으로 알려져 있다. 조직적 핌 응답 설치류 중간 대뇌 동맥 (MCA)에서 감소 된 혈관 내 압력을 측정 하 여 폭발을 이용한 외상 성 뇌 손상 (bTBI), TBI, 영향 처럼 장애인된 대뇌 혈관 반응성에 결과 가설 테스트 고급 폭발 시뮬레이터 (ABS) 충격 관을 사용 하 여 가벼운 bTBI을 복종 하는 쥐에서 세그먼트. 성인, 남성 Sprague-Dawley 쥐 취, intubated, 통풍이 되었고 가짜 bTBI (동일한 조작 및 마 취 폭발 부상 제외) 또는 가벼운 bTBI에 대 한 준비. 쥐를 가짜 bTBI 또는 가벼운 bTBI 희생 30 또는 60 분 후 부상으로이 어 받을 무작위로 지정 되었다. BTBI, 직후 righting 반사 (RR) 억제 번 평가 했다, 안락사 시간 포인트 후 부상에 완료 되었다, 두뇌 수확 했다 고 개별 MCA 세그먼트 했다 수집, 탑재 가압. Intraluminal 압력 동맥 세그먼트 통해 끼얹는다 20 mmHg를 100에서 20 mmHg 단위로 감소 되었다, MCA 직경 측정 하 고 기록 했다. 작은 intraluminal 압력, MCA 직경 꾸준히 증가 크게 가짜 bTBI 그룹에서 기준선 위에 MCA 팽창 응답 크게 감소 했다 (p < 0.05) 장애인에 의해 입증으로 두 bTBI 그룹에서 감소와 함께 MCA 직경 bTBI 그룹에 대 한 기록. 더하여, bTBI 그룹에서 RR 억제는 크게 (p < 0.05) 보다 가짜 bTBI 그룹에서 더 높은. MCA의 수집 가짜 bTBI에서 intraluminal 압력 bTBI 크게 전시 다음 MCA의 수집 하는 동안에 감소를 전시 전형적인 vasodilatory 속성 장애 감소 조직적 vasodilatory 응답 그룹 압력 bTBI 후 적어도 60 분 동안 유지 됩니다.

Introduction

영향 (즉,, 비-폭발) TBI, 폭발을 이용한 외상 성 뇌 손상 (bTBI) 대뇌 혈관 상해¹ 연관 되 고 손상에서 발생 하는 그와 유사한 대뇌 혈관 보상에 대 한 응답 사건 처럼 변경 이산화탄소 (파 코₂)²^,^,³⁴ 와 산소 (파 오₂)⁵의 작업 부분 압력에 또한, 폭발 노출 동물⁶ 와 bTBI 환자⁷^,⁸에 대뇌 동맥 vasospasm을 발생 했습니다. 임상 TBI⁹ 및 유체-타악기 부상 (FPI)¹⁰^,^,¹¹¹² 동맥 혈압에서 변화에 손상된 대뇌 혈관 응답에 연관 된 하는 동안 (예:, 압력 autoregulation)⁹^,¹⁰^,^,¹¹¹², 대뇌 혈관 압력 autoregulation 용량에 bTBI의 효과 관한 불확실성 남아.

대뇌 순환 유지 하는 지속적인 산소와 영양소 공급 metabolically 활성 뇌¹³^,^,¹⁴¹⁵^{, 전달의 목적으로 조직의 동맥 압력에 변화에 반응} ¹⁶. 독특한 유형의 항상성 autoregulation¹⁷^,^,¹⁸¹⁹ 발생 “기관”혈압 (관류) 또는 다른 생리 또는 pathologic 자극의 변화에도 불구 하 고 일정 한 혈액의 흐름을 유지 하는 경우²⁰. 대뇌 동맥 수축 또는 팽창 변화 혈압, 산화 질소 (NO), 혈액 점도, 파₂ 와 파 오₂, 등⁴^,^,¹¹¹⁶^, 에 대 한 응답 ²¹. 동맥 조직적 응답 같은 수축 또는 dilations를 말합니다. 조직적 혈관 응답, 배 일 리스²² 및 CBF의 autoregulation에 기여 하는 주요 메커니즘에 의해 처음으로 설명 및 특징 이다 vasoconstriction 관류 압력이 증가 vasodilatation 관류 압력 감소 하는 경우 ¹⁴ ^, ¹⁷.이 혈관 응답 스트레칭 응답 및 루멘 또는 벽 긴장²³^,²⁴^, 에서 변경 (예: 혈관 평활 근 세포, VSMC의) 수축 성 조직 고유의 능력은²⁵^,^,²⁶²⁷^,^,²⁸²⁹. 동맥은 기지개 하는 때 (예:, 중 혈관 내 압력 증가), VSMC의 수축²⁴^,^,²⁵²⁶^,²⁸.

연구 저항 혈관을 검사 하는 비보 전 일반적으로 고용 절연된 저항 혈관의 약리학 및 생리 적 속성을 테스트 하는 두 가지 방법 중 하나: 링 장착 방법 및 cannulated, 가압 방법. 링 마운트 선박 준비 방법은 장소에 세그먼트를 보유 하 고 있는 선박 세그먼트를 통해 intraluminally를 통과 하는 두 개의 와이어를 포함 한다. 이리저리 지속적인된 철사에 적용 되는 힘의 양을 측정 계기 VSMC의의 자극. 그러나,이 기술은 그걸로 특정 예약, 가장 주목할만 하 게, 피할 수 없는 손상으로 전선을 통해 전달 되는 루멘의 내 피 층으로 지속³⁰ 와 격리 된 세그먼트에 의해 지속적인 스트레칭의 다양 한 학위 차례 차례로 궁극적으로 약리 에이전트³¹그릇의 감도 영향을 미치는 혈관 벽 팽창, 이끌어 낸다. Cannulated, 가압 용기 준비 방법론 각 집 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 배치는 단일 동물에서 수확 하는 두 개의 별도 챔버의 구성 하는 arteriograph를 사용 합니다. micropipette 세그먼트의 각 끝에 삽입 하 고 세그먼트의 인접 끝 봉합 micropipette에 고정 루멘 부드럽게 혈액과 다른 물질을 제거 하기 위해 생리 적 소금물 (PSS) 함께 끼얹는다. 선단부 다음 봉합 보안 됩니다. 과거 또는 luminal 압력 각 세그먼트 위에 하지만 다른³²^,^,³³³⁴^,^{35에 관하여 서로 다른 높이에 적당 한 높이에 각 피 펫에 연결 된 두 개의 저수지를 올려서 설정} ^,³⁶. 압력 트랜스듀서 저수지와 micropipettes 위치 측정을 제공 관류 압력 용기는 거꾸로 한 현미경 모니터, 비디오 카메라 및 외부의 측정을 허용 하는 스케일 러와 복을 사용 하 여 확대는 하는 동안 MCA 직경입니다. 비록 두 가지 방법 모두 귀중 한, cannulated, 가압 용기 준비 방법론을 잘 모방 하 고 허가 혈관 그들의 비보에 조건³²^,³⁷로 수를 조사.

영향 (즉,, 비-폭발) 대뇌 혈관 응답에 TBI 대뇌 동맥 세그먼트²¹^,³⁵^,^,³⁶³⁸에 이전 연구의 다양 한 종류의 효과. 사용 하 여 비슷한 ex vivo MCA 프로토콜 선박 컬렉션, 장착 및 관류 현재 연구에서 설명 된 대로, 이전 연구 얻은 그들의 각각에 대 한 조사 관련된 메커니즘 대뇌 맥 관 구조 부전의 성공 TBI를 다음과 같은. Golding 외³⁴ 검사 성인, 남성 긴 에반스 쥐 MCA의 다음 제어 대뇌 피 질의 영향 (CCI) 부상 가혹한 TBI에 내 피-중재 dilations. 두 번째 연구에서 Golding 외³⁶ MCA의 지속적인 가벼운 CCI 쥐에서 수확 후 저 혈압 또는 CO₂뇌혈관 반응성을 조사. 유 외³⁸ peroxynitrite 넝마 향상된 핌 응답 성인, 남성 Sprague-Dawley 쥐 MCA 세그먼트 FPI 매튜 외.²¹ 조직적 응답을 공부 하는 동안 대상에 혈관 내 압력 감소 여부 분석 MCA 저 혈압은 보통 후 수확의 중앙 FPI.

더 나은 가설을 조사 하기 위해 비 폭발 TBI, 장애인된 대뇌 혈관 반응성에 결과 처럼 그 bTBI 우리가 테스트 조직적 핌 응답 감소 혈관 내 압력을 측정 하 여 손상 된 autoregulation에 기여 하는 메커니즘 절연, 가압 설치류 MCA 세그먼트 (그림 1)는 고급 폭발 시뮬레이터 (ABS) 충격 관 모델 (그림 2 및 그림 3)를 사용 하 여 가벼운 bTBI을 복종 하는 쥐에서 수집에 비보 전 (로드 리 게 스를 참조 외.³⁹ 표 1) 파도 Freidlander 같은⁴⁰ 이상 및 아래 pressure를 생성 하는 드라이버 챔버에 직접 배달 하는 압축 공기를 사용 하 여 (로드 리 게 스를 참조 외³⁹그림 1A).

그림 1 : 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 위치. MCA의 후부 대뇌 동맥 (PCA), 내부 경 동맥 (ICA), 외부 경 동맥 (ECA), 두개골 기저 부의 동맥 (BA)와 일반적인 경 동맥 (CCA)의 위치를 강조 하는 쥐 두뇌의 복 부 전망. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 폭발 시뮬레이터 (ABS) 충격 관 장치 고급. ABS 생산 모든 연구 동물에서 1 차 폭발 부상 하는 데 사용. 1 = 드라이버 챔버; 2 = 확장 챔버; 3 = 견본 약 실; 4 = 반사 파 억압; 노란 별 표본 트레이 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

모든 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 의료 지점, 평가 대 한 협회의 대학에 의해 승인 했다 및 실험실 동물 배려 (AAALAC)의 인증 인증 시설. 1. 동물 준비 ABS 폭발 부상에 대 한 기계적 설치류 볼륨 환풍기를 켜고 40-45 호흡 분 당 사이 호흡 속도 설정. 스위치는 이와 데우는 담요에 제어 하 고 블루 패드 위에 테이프. 호흡기에 호흡기 호스를 연결 합니다. Endotracheal 삽 관 법 썰매, 후 두 경, 긴 픽업 핀셋, stylet, endotracheal 튜브를 수집 하 고 면봉 1 %0.05 mL Lidocaine HCl. 구성 블루 패드에 젖 었. 쥐 마 취 “거품” 챔버, 송풍기, 공기 챔버와 isoflurane 챔버 호스는 안전 하 게 연결 하 고 그들의 각각 플러그 또는 소켓에 연결 된 확인 합니다. 마 취 거품 약 실 클램프 되어야 오픈; 환풍기 클램프가 닫힙니다. 공기 챔버에 2 L/min와 산소 1 L/min를 위한 손잡이를 방 공기에 대 한 노브를 설정 합니다. 켜고는 isoflurane 볼륨 혼합물의 4%에 노브를 설정 합니다. 타이머를 시작 하 고 4-6 분에 대 한 마 취 거품 약 실에서 젊은 성인 (≈3 개월), 남성 Sprague-Dawley 쥐 (350-400 g) 장소. 2 분 마크에서 쥐를 무게. 쥐 완전히 부드럽게 뒷 발 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취를 확인 합니다. 아니 발 철수 관찰 방 공기를 줄일 고 1 L/min, 0.4 L/min에 산소와 isoflurane 볼륨 혼합물의 2%에 노브를 설정 합니다. 직장 telethermometer 온도 모니터를 켭니다. 호흡기에 클램프를 열고 마 취 거품 약 실에 클램프를 닫습니다. 마 취 거품 약 실 그리고 endotracheal 삽 관 법 썰매에 위치에서 쥐를 제거 합니다. 쥐 넣어야 후 두 경 동물의 입에, 사용 방법, 혀를 오래 픽업 족집게 목 구멍 안에 따라 면봉 lidocaine 흠뻑 목화 면봉 팁 놓고 부드럽게 stylet endotracheal 튜브를 포함 하는 쥐의 기관지로 삽입 합니다. 일단 intubated, endotracheal 튜브의 외부 끝에 호흡기 호스의 끝을 삽입 하 고 관찰 하 고 꾸준히 하 고 어려움 없이 쥐가 호흡을 확인. 장소는 혀 매듭에서 자유롭다 돌보는으로 endotracheal 튜브 타이. 하얀 석유 젤리 직장 telethermometer 프로브를 적용 하 고 바로 꼬리 아래 삽입. 견본 약 실에서 ABS 견본 트레이 제거 하 고 트레이에 쥐 배치 전에 온난화에 대 한 열 램프 아래에 놓습니다. 눈 위에 시작 하는 쥐의 피의 상단 면도 귀 사이. 표준 크기의 발포 귀 플러그가 위로 동일한 반으로 잘라. 플러그의 기지의 중심에서 시작 하 고 둥근된 끝까지 똑바로 잘라. 봐서 고 막으로 접촉을 만들 때까지 각 귀 팁 귀 운하를 따라 처음으로 등분된 조각을 삽입 합니다. 직장 온도 모니터링 합니다. 37 ° C의 온도 도달 하면 쥐 ABS 견본 쟁반에 로드 될 준비가 되어 있습니다. ABS 견본 쟁반에 쥐를 보호 합니다. Endotracheal 튜브에서 호흡기 호스를 제거 하 고 신속 하 게 하지만 부드럽게 쥐 여 머리 홀더 고무 고리를 통해 머리를 부드럽게 인도 쟁반의 맨 끝으로 밀어. 인공 호흡기 호스 endotracheal 관으로 다시 꽂아 확인 그것은 아니지만 안전 하 게 되도록 고무 고리 단단히 목에 쥐 가로 수 그린 위치 (그림 3)에 누워 있다 확인 하십시오. 끄고는 isoflurane endotracheal 튜브에서 호흡기 호스를 제거 합니다. 잠금 및 ABS 견본 트레이 마 취 쥐 ABS 견본 약 실에 포함 된 보안. 부드럽게 핀치 뒷 발 발가락 긴 핀셋을 사용 하 여 모든 3 s까지 철수 반사 반응 elicited. 2. ABS 폭발 장치 준비 및 폭발 TBI 유도 참고: ABS는 쥐를 로드 하 고 견본 약 실에 확보 후 폭발 부상 관리 권리에 대 한 준비가 그래서 프로토콜 단계 2.1-2.10 일반적으로 단계 1.1-1.22로 동시에 완료 됩니다. 드라이버 챔버 (그림 4B)에서 탈출 하 고 그것의 물개에서 챔버를 풀고 어떤 잔여 덫을 놓은 공기를 허용 하기 위하여 유압 핸드 펌프(그림 4)손잡이 풉니다. 드라이버 챔버를 둘러싼 모든 스레드 막대 (그림 4D)에서 모자 견과 (그림 4C)를 풀고 왼쪽 및 확장 챔버 (그림 4E)에서 챔버 슬라이드 합니다. 두 개의 모든 스레드 봉와 드라이버 사이 mylar 시트의 배치를 허용 하기 위해 드라이버 챔버와 확장 챔버의 상단에 있는 그들의 해당 캡 너트를 완전히 제거 합니다. 스택 및 위쪽 가장자리 4 사전 컷 따라 함께 및 사전 측정 테이프 (30cm 길이, 20 cm 폭, 0.004 인치 두께) 사용 하 여 마스킹 테이프의 2.54 cm 조각 mylar 시트 (형성 mylar ‘ 막’). 드라이버 및 확장 챔버 (그림 4F) 사이 개통 센터 확장 챔버의 상단에 mylar 멤브레인의 위쪽 가장자리를 테이프 테이프의 두 번째 조각을 사용 하 여, 안전 하 게. Mylar 멤브레인에 대 한 드라이버 챔버 챔버와 손을 강화의 상단에서 두 개의 모든 스레드 봉 챔버를 둘러싼 모든 캡 너트를 대체 하 여 보안. 안전 하 게 맞는까지 유압 핸드 펌프 블록 및 드라이버 챔버에 대 한 액세서리 강철 블록을 놓으십시오. 유압 핸드 펌프 손잡이 강화 하 고 드라이버 챔버 유압 게이지에 일정 한 압력 임계값을 관찰 하 여 아니 누수와 함께 가압 유지 확인 합니다. ABS ABS 폭발 장치 컴퓨터에 폭발 장치 압력 흔적을 기록 하는 방 아 쇠 수집 파일을 엽니다. 압축 공기 탱크의 (그림 4G) 주요 손잡이 충분히 기도 약간 여를 풉니다. 게이지 표시기 ≈5, 000 psi의 원하는 챔버 압력 수준을 나타내는 빨간색 화살표에 도달할 때까지 유압 핸드 펌프를 작동 합니다. 보안 및 ABS 견본 트레이 (그림 4H)에 마 취 동물 가로 수 그린 위치 (그림 3)에 놓고 (그림 4나) ABS 견본 약 실에 견본 트레이 잠금. 부드럽게 핀치는 뒷 발 각 3 긴 핀셋을 사용 하 여 s까지 철수 반사 반응 elicited. ABS 폭발 장치 컴퓨터에 열린된 수집 페이지에서 시작 을 클릭 합니다. ‘Acquisitioning’ 창이 화면에 나타납니다, 일단 누르고 방 아 쇠는 ABS 폭발 장치 폭발 되 면, mylar 멤브레인을 파열 하 고 쥐를 ABS 폭발 부상 (20.9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) 관리까지 있습니다. 직후 폭발 폭발, 얼마나 많은 시간 (최소 및 s) 후 부상 경과 추적 하려면 두 번째 타이머를 시작 합니다. ABS 견본 쟁반에서 쥐를 제거 하 고 블루 패드과 지구 온난화 담요, 완벽 하 게 반사 억제를 righting의 평가 대 한 그의 뒤에 그를 배치. Righting 반사의 반환을 위한 시간을 기록 합니다. 두 번째 타이머, 문서 분 및 s 후 부상 걸리는 그의 위 세에 그의 뒤에서 롤을 쥐에 대 한 연속 시간 되는 시간 길이 관찰. 마 취 거품 약 실에 쥐를 반환 합니다. 드라이버 챔버 완화와 운동에 대 한 수 있도록 유압 핸드 펌프 손잡이 풉니다. 기도 닫기 위하여 압축 공기 탱크의 주요 노브를 조입니다. 그림 3 : 쥐 배치 ABS 견본 쟁반에 고 절대 내부 방향 및 ABS 내부 연구 동물의 방향 복 근에 배치, 동물 충격파 방향 (빨간 화살표)에 수직으로 머리의 등 쪽 표면 가로 경향이 위치에 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 고급 폭발 시뮬레이터 (ABS) 충격 관 장치 회로도. ABS의 주요 구성 요소입니다. A = 유압 핸드 펌프; B = 드라이버 챔버; C = 모자 견과; D = 모든 스레드 봉; E = 확장 챔버; F = mylar 멤브레인 배치;의 위치 G = 압축 공기 실린더; H = 견본 쟁반; 나 = 견본 약 실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 3입니다. 설치류 MCA PSS 솔루션의 준비 참고: 단계 1.1-1.22 PSS 솔루션 사용으로 프로토콜 단계 3.1-3.3 일반적으로 동시에 완료 됩니다. 준비 하 고 다음과 같은 구성 및 농도의 1000 mL 생리 소금 솔루션 (PSS)를 혼합: 130 mM NaCl; 4.7 m m KCl; 1.17 m m MgSO4∙7H2O; 5 mM 포도 당; 1.5 m m CaCl2; 15 m m NaHCO3. 21% O2 와 N2의 균형에 5% CO2 의 가스 혼합 PSS equilibrate 이 솔루션은 pH 7.4 읽을 때 준비.참고: 모든 가스는 위에서 언급 한 농도에서 압축된 가스 실린더에서 얻을 수 있습니다. 저수지 병과 준비 된 PSS 솔루션 튜브를 나머지 솔루션을 진정 수 있습니다. 4입니다. 설치류 MCA 세그먼트의 추출 Righting 반사 시간을 문서화, 후 마 취 거품 약 실에 쥐를 반환 합니다. 클램프는 인공 호흡기를 닫고 챔버에 클램프를 엽니다. 볼륨 혼합물의 4%에 isoflurane 바뀌고 깊은 마 취 때까지 2-3 분 동안 상공에 쥐를 유지. 일단 쥐 취 호흡기에 클램프를 열고 마 취 거품 약 실에 클램프를 닫습니다. isoflurane 볼륨 혼합물의 2%로 감소 하 고 거품 약 실에서 그를 제거. 그 지구 온난화 담요에 그의 속에 놓고 다시 endotracheal 튜브의 외부 끝에 호흡기 호스의 끝을 삽입 합니다. 30 또는 60 분 동안 분 당 40-45 호흡 사이의 볼륨 혼합물의 2% 마 취 호흡 속도에서 기계 환기를 유지 게시물 bTBI 부상 즉시. 30 또는 60 분 생존 시간, 볼륨 혼합물의 4 %isoflurane 증가 및 깊이 5-6 분에 대 한 즉시 anesthetize 후 잘린 설치류 전용 단두대를 사용 하 여 안락사.참고: 이 실험에서 우리가 유지 동물 마 취 및 기계적 통풍이 righting의 반환 다음 반사 잘린까지. 연구는 더 이상 생존 timepoints 경우, 마 취에서 진통제 출현 하기 전에 동물을 관리 한다. 섬세 하 게 두개골에서 뇌를 제거 합니다. #10 메스 블레이드를 사용 하 여 후 두 관절 돌기 아래로 면도 두 피 위쪽에서 중앙, 1.5 인치 세로, 뼈 깊은 절을. 작은 뼈 rongeurs를 사용 하 여 두 피 피부 두개골 뼈에서 분리를 열고. 큰 뼈 rongeurs를 사용 하 여 삭감 하 고는 후 두, interparietal, 및 뇌 인 전 두 뼈의 아래쪽 절반 추출. 수술 주걱을 사용 하 여 신중 하 게 두뇌는 주변 뼈의 무료 일단 두개골에서 뇌를 발굴.참고: 두개골 벽에서 세그먼트 그래서 하지 불필요 하 게 예인선, 멍 청이 아니면 섬세 한 MCA 두개골에서 뇌를 분리 하는 경우 극단적인 주의 가져가 라. 작은 유리는 단단한 얼음 블록의 위에 휴식 하 고 직접 페 트리 접시에 포함 된 냉장된 PSS 솔루션으로 수확된 두뇌를 입금. 조심 스럽게 모두 왼쪽과 오른쪽 MCA에서 시작 하 여 윌리스의 원을 제거. 계속 약 4-5 m m에 대 한 측면 및 dorsally 세그먼트를 제거 합니다. 부드럽게 청소 microforceps를 사용 하 여 모든 결합 조직의 길이에서 약 4-5 mm의 수집된 MCA 세그먼트. MCA의는 arteriograph에 탑재 합니다. 첫 번째 유리 제 micropipette (직경 ≈70 µ m)와 각 세그먼트의 근 위 끝을 cannulate 및 10-0 나일론 봉합과 보안. 부드럽게 루멘에서 어떤 잔여 혈액 및 기타 내용을 제거를 PSS와 루미나 perfuse. MCA 세그먼트 스트레칭 없이 두 번째 micropipette 각 세그먼트의 선단부를 cannulate 하 고 10-0 나일론 봉합으로 확보. MCA 세그먼트의 성공적인 설치 후 혈관의 확대에는 거꾸로 한 현미경의 스테이지 위에 챔버를 놓습니다. 현미경은 비디오 카메라, 모니터 및 동맥 직경 측정용 광학 마이크로미터와 보정 비디오 스케일 러를 갖추고 있습니다. 37 ° C로 실 온에서 예 열 하 고 21% O2 와 N2의 균형에 5% CO2 의 가스 혼합물 equilibrated 지속적으로 유통된 PSS에 채워 각 세그먼트와 주변 arteriograph 목욕. 60 분 50 mmHg의 압력에 MCA 세그먼트 세그먼트 위에 적절 한 높이를 micropipettes에 연결 된 저수지 병 올려서 equilibrate. 압력 변환기 micropipettes와 저수지 병 사이 위치한 원하는 50 mmHg 압력을 달성 하는 때를 나타내는 MCA 세그먼트 내의 과거 압력을 평가할 것입니다. 재래식 기간의 결론 후 저수지 병 서로 다른 높이에 설정 하 여 100 mmHg 혈관 내 압력을 증가. 30 m m K+ (혈관 수축의 확인)를 제공 통해 luminal perfusate 및 측정 동맥 직경. 약 10 분 후 10-5 M Ach (대 한 배 팽창)을 전달 하 고 동맥의 직경을 측정. 선박 핌 응답을 검사 합니다. 낮은 80 mmHg를 100 mmHg에서 혈관 내 압력을 줄이기 위해 저수지 병. MCA 세그먼트 10 분 측정 동맥 직경에 대 한 equilibrate를 허용 한다. 80 mmHg에서 60 mmHg 혈관 내 압력을 줄일. MCA 세그먼트 10 분 측정 동맥 직경에 대 한 equilibrate를 허용 한다. 40 mmHg를 60 mmHg에서 혈관 내 압력을 감소 시키십시오. MCA 세그먼트 10 분 측정 동맥 직경에 대 한 equilibrate를 허용 한다. 20 mmHg를 40 mmHg에서 혈관 내 압력을 감소 시키십시오. MCA 세그먼트 10 분 측정 동맥 직경에 대 한 equilibrate를 허용 한다.

Representative Results

모든 연구 동물에 대 한 평균 bTBI 압력 20.9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9) 이었다. ABS bTBI 충격파 노출 (5.37 분 ±2.1)를 받게 하는 쥐에 대 한 반사 (RR) 억제 righting의 평균 기간 크게 더 길었다 (p = 0.36, 가짜 대 bTBI) 보다 가짜 그룹 (5.10 분 ±1.6). 모두는 30 및 60 분 가짜 그룹, MCA 직경 증가 기준선 위에 intraluminal 압력 100에서 20 mmHg 감소 했다. 해당 가짜 그룹에 비해, MCA 핌 응답 지속을 부과 하는 관찰 된 30 분의 혈관 내 압력에 있는 감소 (p = 0.01, 가짜 대 bTBI) 60 분 (p = 0.02, 가짜 대 bTBI) ABS bTBI 그룹은 폭발 노출 (그림 5) 이후 감소 크게. 이러한 결과의 자세한 내용은 참조 로드 리 게 스 외.39. 이러한 연구는 가벼운 bTBI 크게 손상 대뇌 보상 팽창 응답 MCA 세그먼트 이러한 연구에 사용 하는 가벼운 쇼크 웨이브 수준 동안 가벼운 bTBI 후 30 그리고 60 분의 기간에 결과에 감소 된 혈관 내 압력을 공개 RR의 억제 (< 30 s) 가짜 부상 쥐에 유사한. 통계 분석 소프트웨어와 함께 수행 했다. 혈관 내 압력의 변화에 조직적 대응 intraluminal 압력 (80, 60, 40, 및 20 mmHg)의 각 수준에 대 한 기준선 (100 mmHg)에서 백분율 변화를 계산 하 여 평가 되었다. 짝이 없는 학생의 t-테스트는 bTBI와 가짜 그룹 베이스 라인 간의 차이 평가 하기 위해 사용 되었다. BTBI 및 가짜 그룹 MCA 팽창 응답 차이 동일한 분산에 대 한 반복 된 단방향 분산 분석 (ANOVA) Dunnett의 여러 비교 테스트와 바 틀 렛의 테스트를 사용 하 여 평가 됐다. 반복 테스트 결과 통계적 인 힘에서 감소 인해 각 특정 시점 압력 MCA에서 비교 실험 (예:, 100 및 80 mmHg 사이 또는 60 40 mmHg 사이, 등) 실시 했다. 중요성 p ≤ 0.05에서 받아들여졌다 수준. 모든 데이터, 텍스트, 참조 되는 테이블, 및 그림에서 ± 표준 오류 (SEM)의 수단으로 표현 된다. 그림 5 : 중간 대뇌 동맥 (MCA) 응답 감소 혈관 내 압력에 bTBI의 효과. 혈관 내 압력에 있는 진보적인 감소를 팽창 시키는 응답 장애인된 vasodilatory 응답을 전시 하 고 30 분에서 크게 감소 했다 (p = 0.01, 가짜 대 bTBI) 60 분 (p = 0.02, 가짜 대 bTBI) bTBI 그룹 (n = 6/그룹) 모두 가짜 그룹에 비해 폭발 노출 후 (n = 12). 모두는 30 및 60 분 가짜 그룹, MCA 직경 증가 기준선 위에 intraluminal 압력 100에서 20 mmHg 감소 했다. 값은 ± SEM. 수단으로 그려집니다 *p < 0.05 가짜 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

모든 프로토콜 및 지침, 그것은 필수적이 특정 연구 프로토콜에 대 한 특정 단계는 정확 하 게 준수 하 고 가능한 한 정확히. 쥐의 초기 삽 관 법 후 꾸준히 하 고 어려움 없이 호흡을 확인 하는 것이 중요 하다. 실수로 기도 대신 식도 endotracheal 튜브 삽입 rasping, 어려운 호흡, 출혈과 폐에 부족 한 마 취 배달 때문 쥐의 후속 화끈한 높아집니다.

드라이버 및 확장 챔버 사이 개통의 센터를 통해 mylar 멤브레인 시트를 찍고 때 시트 중심으로 하 여³⁹^,⁴¹전체 커버 필수적입니다. 개방을 통해 시트를 이후 하는 것은 드라이버 챔버, 막 파열-잠재력에 대 한 필요한 압력과 폭발 부상의 관리의 거부에 있는 하락에서 공기 누출 귀 착될 것 이다. 제대로 situating과 액세서리 강철 블록을 안전 하 게 피팅 유압 핸드 펌프에 대 한 블록 및 드라이버 챔버 유압 핸드 펌프 손잡이 강화는 필수적 이며 또한 누수 없이 가압 남아 드라이버 챔버를 확인. 철강 블록의 적절 한 배치를 밀접 하 게 따라서 Mylar 멤브레인 시트와 드라이버 및 확장 챔버 사이 개방 챔버에 필요한 필수 인감을 만드는 확장 챔버에 대 한 드라이버 챔버에 대 한 수 있습니다.

MCA 선박 추출 전에 준비, 21% O₂ 와 N₂ 의 균형에 5% CO₂ 의 필요한 혼합물 PSS 가스 솔루션 equilibrates 하는 동안에 필요한 필요한 중립 생리 적 pH를 용이 하 게 한 PSS 솔루션²¹^,³³^,³⁴일.

매우이 단계 다음 중 표시 되는 최대 팽창 수축 하는 세그먼트를 허용 의무는 60 분²¹^,³²^,^,³³³⁴ 에 대 한 일정 한 압력에서 세그먼트 평형 그들의 첫 번째 기본 가압입니다. 이 이벤트의 자연, 건강 한 동맥³²^,^,³³³⁴의 암시 속성 발생 보여 줍니다. 비록 다른 연구³³^,^,³⁴⁴²,이 연구와 매튜의 세그먼트 평형에 대 한 여러 압력 수준을 이용 되었습니다 외.²¹, Golding 외.³⁵ 그리고 Golding 외⁴³ equilibrated 50 mmHg에서 세그먼트. 평형 수집 하는 동안 40 mmHg-100 mmHg³² 사이 아무 데도 세그먼트 수 일부 유연성 및 프로토콜의 해당 단계에 대 한 수정에 대 한 그 압력 매개 변수 내에서 평형 시간 궁극적으로 건강 확인 실험의 계속에 필요한 동맥입니다.

그 배를 그대로 유지 하면서 뇌 두개골 및 윌리스의 원형에서 왼쪽 및 오른쪽 MCA 세그먼트에서 분리할 때 극단주의 복용 하는 것입니다 아마도 전체 프로토콜의 가장 중요 한 단계. 뼈 rongeurs와 뇌를 puncturing 끊어지고 또는 제거 하는 동안 세그먼트의 심각한 스트레칭, 실수로 혈관 수술 주걱으로 당기는 두개골에서 뇌를 발굴 궁극적으로 귀 착될 것 이다 파괴는 수확의 때 MCA, unserviceable 세그먼트를 일으키는 원인이 되 고 궁극적으로 그 동물에 대 한 전체 실험 voiding 동맥의 그의 세트의 사용을 중단.

비록 영향 후 수집 MCA 세그먼트 비보 전 핌 또는 constrictory 자극을 대뇌 혈관 응답 측정 또는 폭발 TBI vivo에서 성공에 굴복 했다, 방법론은 그것의 어려움 및/또는 제한 없이. 아마도 더 뚜렷한 복잡 한 연결 대뇌 맥 관 구조에의 순환에 TBI의 결과 검토 중 다양 한 자료로 인해 발생 한 암시적 효과에서 배에 TBI의 명시적 효과 분리는 고 부상된 두뇌⁴⁴에 의해 생성 된 요소입니다. 생각할 수 있는 당황이 잠재적으로 분석 하 여 피할 수 있습니다 ex vivo의 vasoconstrictory 및 vasodilatory 반응 수확, 끼얹는다 또는 MCA의 가압. 대뇌 동맥 vivo에서 로컬로 죽음 이전 parenchymal vasoactive 소재 방전에 노출 되는 시간의 기간을 줄이기 위해 노력, 직접 TBI 후 대뇌 동맥의 컬렉션 같은 장기 노출의 정도 줄일 수 있습니다. 효과입니다. 격리 된 MCA에 대 한 vivo 연구 전 또한 특정 수용 체 주 작동 근 그리고 길 항 근의 사용을 통해 외상 성 혈관 부상의 메커니즘 또는 평판이 좋 ㄴ 차량으로 감시를 용납할 것 이다 혈관 부상의 분석의 전망 제시 효율적으로 또는 vivo에서 차별로. 그 후, ex vivo 메서드가 ex vivo 노출 테스트 결과 조직적 응답 (vasoconstriction 또는 혈관 내 또는 extravascular 약물 노출으로 인해 선박 세그먼트의 팽창 시킴) 하는 약물을 함께 결합할 수 있습니다.

다른 한계는 대략 또는 초조 하 게 따라서 그들의 사용을 무효화 하는 선박의 조 찢기 귀 착될 수 있는 수확된 두뇌에서 MCA의 제거 포함 합니다. 또한, 동물의 안락사 사이 경과 몇 분을 보내는, 혈관 및 준비 PSS 솔루션에 그들의 배치의 컬렉션 수 또한 부정할 그들의 생존 능력. BTBI 처음부터 끝까지 몇 시간을 소요 하 고 성공에 필요한 시간의 길이 단축에 시도 후 MCA의의 조직적 응답을 테스트 하기 위해이 프로토콜에서 설명 하는 방법 실험에서 발생할 수 있습니다 제대로 수행 하 고 다음, 오류가 발생 했습니다. 그러나,이 방법은 이루어집니다 생체 외에서 그리고 상당히 더 많은 비용 효율적인 계측 및⁴⁵^,⁴⁶ 또는 기존의 도플러 초음파 이미징 vivo에서 고해상도 자기 공명 (MR) 보다 장비 활용 / velocimetric 기법⁴⁷^,^,⁴⁸⁴⁹ 도 선박 연구에 대 한 고용.

이러한 결과 가벼운 bTBI 상해는 감소 된 혈관 내 압력에 손상된 대뇌 핌 응답와 관련 된 잠재적으로 vasospasm⁶^,⁷ VSMC hyperconstriction⁵⁰ 의 기능 수 있습니다. 이전 발생에 궁극적으로 지도 하는 같은 폭발 노출 상대 대뇌 관류 감소 후 보고. 또한, 폭발-손상 대뇌 맥 관 구조의 정상적인 돌려보낼 반응 저해 수 가능성이 홍보 더 감소 대뇌 관류 동맥 저 혈압, 전투 작전 동안 빈번한 발생률과 결합 될 때.

이러한 결과 bTBI 동맥 혈관 제어를 촉진 하는 메커니즘을 변경에서 결과 나타냅니다. 적어도 한 시간 후 부상에 대 한 혈관 내 압력 감소 동맥 조직적 응답의 급성 단계 대뇌 혈관 장애, 관찰 되었다 거기 간격 정보 bTBI 후 급성 단계 주변에 남아 있다. 대뇌 맥 관 구조에 어떤 물리적, 생화학 적 결함 부상 및 bTBI 원인 상당히 부상 직후 치료 및 재활 성공의 수준을 결정 하는 데 도움이 수에 뇌 노출 식별의 중요성.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

연구는 무디 프로젝트 변환 외상 성 뇌 부상 연구와 미국 육군 의료 연구 및 재료 명령-국방부에서 수상 W81XWH-08-2-0132 지원 팀의 일환으로 완료 되었습니다.

Materials

Advanced Blast Simulator (ABS)	Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc.	N/A	Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries
Adult, male, Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	N/A	Experimental animals
Arteriograph	Living Systems Instrumentation, Inc.	Arteriograph	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Bone rongeurs, large	FST Fine Science Tools	Friedman Rongeur	Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small	FST Fine Science Tools	Boynton Rongeur	Brain extraction from skull
CaCl₂	Sigma	Calcium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs	3M	Foam Ear Plugs 1100 Class AL	Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine
Glucose	Sigma	D-[+]-Glucose	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	Isoflurane, USP	Anesthetic
KCl	Sigma	Potassium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO₄•7H₂O	Sigma	Magnesium sulfate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps	Buxton Biomedical Inc.	Micro Tying Fcps, 180mm	Brain extraction from skull
Mylar sheets	Texas Art Supply	Mylar	Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl	Sigma	Sodium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO₃	Sigma	Sodium bicarbonate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture	Ethicon	10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm)	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Scalpel blade #10	Bard-Parker	10 Stainless Steel Surgical Blade	Brain extraction from skull
Surgical spatula	Delmaks Surgico	Cement Spatula	Brain extraction from skull
Thermometer	Physitemp Instruments, Inc.,	Thermalert Monitoring Thermometer	Monitoring of experimental animal's core body temperature
Volume ventilator	Harvard Apparatus, Inc.	Small Animal Ventilator	Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket	Gaymar Industries, Inc.	Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad	Maintenance of experimental animal's body temperature

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Citer Cet Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).