Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Uylissa A. Rodriguez; Yaping Zeng; Margaret A. Parsley; Bridget E. Hawkins; Donald S. Prough; Douglas S. DeWitt

doi:10.3791/58792

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Neurosciences

Effets de neurotraumatologie induite par le souffle sur les rongeurs sous pression du milieu des artères cérébrales

Published: April 01, 2019

doi:

10.3791/58792

Uylissa A. Rodriguez^1,2, Yaping Zeng^1,2, Margaret A. Parsley^1,2, Bridget E. Hawkins^1,2, Donald S. Prough^1,2, Douglas S. DeWitt^1,2

¹Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch, ²The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research,University of Texas Medical Branch

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à décrire les méthodes pour ex vivo détermination de vasoréactivité suite à une explosion primaire traumatisme crânien (bTBI) utilisant des segments isolés, sous pression, rongeurs milieu artériel cérébral (MCA). bTBI induction s’effectue à l’aide d’un tube de choc, également connu sous le nom d’un dispositif avancé Blast Simulator (ABS).

Abstract

Il y a eu des études sur les effets histopathologiques et comportementales de l’exposition de l’explosion, moins ont été consacrées aux effets vasculaires cérébraux blast. Traumatisme crânien, (TBI) impact (c’est-à-dire non, jet) est connue pour diminuer l’autorégulation de la pression dans les vaisseaux cérébraux chez les humains et les animaux de laboratoire. L’hypothèse qu’induite par le souffle traumatisme crânien (bTBI), comme l’impact sur le TBI, se traduit par la réactivité vasculaire cérébrale altérée a été testé en mesurant une réponse dilatoire myogène à pression intravasculaire réduite en rongeur artère cérébrale moyenne (MCA) segments de rats soumis à bTBI doux avec un tube de décharge Advanced Blast Simulator (ABS). Rats Sprague-Dawley adultes, mâles ont été anesthésiés, intubés, ventilés et préparés pour Sham bTBI (manipulation identique et l’anesthésie à l’exception de la blessure de l’explosion) ou doux bTBI. Des rats ont été assignés au hasard à recevoir bTBI Sham ou doux bTBI suivie de sacrifice 30 ou 60 min après l’accident. Immédiatement après bTBI, redressement réflexe (RR) suppression fois ont été évalués, l’euthanasie à la fois points après l’accident a été achevé, le cerveau a été récolté et les différents segments MCA ont été recueillies, montés et mis sous pression. Comme la pression intraluminale perfusée par les segments artériels a été réduite à 20 mmHg par incréments de 100 à 20 mmHg, diamètres MCA ont été mesurés et enregistrés. Avec la diminution de la pression intraluminale, diamètres MCA régulièrement augmentés considérablement au-dessus de référence dans les groupes de bTBI Sham tandis que MCA dilatateur réponses ont été significativement réduites (p < 0,05) dans les deux groupes bTBI comme en témoigne les visuels, plus petit Diamètres MCA a enregistré pour les groupes bTBI. En outre, suppression de RR dans les groupes bTBI était significativement (p < 0,05) plus élevé que dans les groupes de bTBI Sham. MCA est recueilli de la Sham bTBI expose les propriétés vasodilatatrices typiques à des diminutions de la pression intraluminale tandis que MCA a recueilli suite bTBI présenté significativement réduite myogènes réponses vasodilatatrices réduit de groupes de pression qui a persisté pendant au moins 60 min après bTBI.

Introduction

Similaire à celui résultant des chocs (c’est-à-dire non, jet) TBI, induite par le souffle traumatisme crânien (bTBI) a été associée à une lésion vasculaire cérébral¹ et malentendants réponses compensatoires vasculaires cérébrales d’occurrences aime changements dans les pressions partielles du dioxyde de carbone (PaCO₂)²^,³^,⁴ et l’oxygène (PaO₂)⁵. En outre, l’exposition explosion a provoqué un vasospasme artériel cérébral animaux⁶ et bTBI patients⁷^,⁸. Tandis que clinique TBI⁹ et blessures fluide-percussion (FPI)¹⁰^,¹¹^,¹² sont associées par altérée réponses vasculaires cérébrales aux changements dans la pression artérielle (p. ex., pression d’autorégulation)⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹², incertitudes subsistent en ce qui concerne les effets de bTBI sur la capacité d’autorégulation de la pression vasculaire cérébrale.

La circulation cérébrale réagit aux variations de la pression artérielle systémique dans le but de maintenir un continu d’oxygène et de nutriments envoyées au cerveau métaboliquement actif¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶. Un type unique de l’homéostasie, l’autorégulation¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ se produit lorsque « un organe maintient un flux constant de sang malgré les changements de pression artérielle (perfusion) ou d’autres stimuli physiologiques ou pathologiques »²⁰. artères cérébrales se contracter ou se dilater en réponse aux variations de la pression artérielle, l’oxyde nitrique (NO), la viscosité du sang, PaCO₂ et PaO₂, etc.⁴^,¹¹^,¹⁶^, ²¹. la réponse myogénique artérielle se réfère à ces contractions et dilatations. La réponse vasculaire myogène, d’abord décrit par Bayliss²² et un mécanisme important qui contribue à l’autorégulation du CBF, se caractérise par si la pression de perfusion augmente la vasoconstriction et la vasodilatation, si la pression de perfusion diminue ¹⁴ ^, ¹⁷. cette réponse vasculaire est la capacité intrinsèque des tissus contractiles (telles que les cellules de muscle lisse vasculaire, CMLV) pour répondre à étirer et/ou modifications dans lumen et/ou mur tension²³^,²⁴^, ²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Lorsque les artères sont tendus (par exemple, au cours de la pression intravasculaire augmente), CMLV contracter²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁸.

Les études qui examinent les vaisseaux résistifs ex vivo ont employé couramment une des deux méthodes pour tester les propriétés physiologiques et pharmacologiques des vaisseaux de résistance isolée : la méthode monté sur bague et la canulés, pressurisé méthode. La méthode de préparation de bateau monté sur bague implique deux fils passés intraluminales dans le segment du navire, le segment de maintenir en place. Mesurer la quantité de force exercée sur les fils isométriquement soutenues gabarits de la stimulation de la CMLV. Cependant, cette technique comporte certaines réserves, notamment, les dommages inévitables soutenu par la couche endothéliale de la lumière que les fils sont passés à travers elle³⁰ et le degré variable des étirements subis par le segment isolé qui à son tour conduit à la distension de mur de navire, en fin de compte qui affectent la sensibilité du navire à des agents pharmacologiques³¹. La méthodologie de préparation de bateau canulés et sous pression utilise un arteriograph composé de deux chambres séparées qui chaque maison le placement d’une artère cérébrale moyenne (MCA) récoltée dans un seul animal. Une micropipette est insérée dans chaque extrémité du segment, l’extrémité proximale du segment est fixée à la micropipette avec sutures et la lumière est doucement perfusée avec une solution saline physiologique (PSS) afin d’éliminer le sang et autres substances. L’extrémité distale est ensuite fixée avec des sutures. Transmurale ou pression Luminale est définie en soulevant les deux réservoirs attachés à chaque pipette jusqu’à une hauteur convenable au-dessus de chaque segment, mais à des hauteurs différentes en ce qui concerne les autres³²^,³³^,³⁴^,³⁵ ^,,³⁶. Capteurs de pression placés le long des réservoirs et des micropipettes fournissent une perfusion intensimétrie tandis que les navires sont amplifiés à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un moniteur, caméra vidéo et un mesureur permettant la mesure de l’externe Diamètres de MCA. Bien que les deux méthodes sont utiles, la méthodologie de préparation de bateau canulés et sous pression imite mieux et permis les vaisseaux étudiés pour se rapprocher de leur in vivo des conditions³²^,³⁷.

Les effets de différents types d’effets (p. ex., non-blast) TBI sur les réponses vasculaires cérébrales ont précédemment étudié en segments artériels cérébraux²¹^,³⁵^,³⁶^,³⁸. Employant un semblable ex vivo protocole de MCA pour collection de navire, de montage et de perfusion comme décrit dans la présente étude, des études antérieures obtient de succès avec leurs enquêtes respectives sur les mécanismes connexes du dysfonctionnement du système vasculaire cérébral suite de TBI. Golding Al³⁴ examiné dilatations endothéliale induite en adultes, mâles Long-Evans rat de MCA après TCC sévère blessure contrôlé impact corticale (CCI). Dans une seconde étude, Golding Al.³⁶ a étudié la réactivité cérébro-vasculaire à l’hypotension ou CO₂après la récolte de MCA de rats ayant subi une CCI doux. Yu et al.³⁸ a analysé si peroxynitrite charognards améliorée dilatoire réponses réduit pression intravasculaire dans adultes, mâles Sprague-Dawley rats MCA segments soumis à FPI tandis que Mathew et al.,²¹ ont étudié les réactions myogènes à hypotension chez MCA de récolté après modérée, central FPI.

Pour mieux étudier l’hypothèse que bTBI, comme non-blast TBI, résultats douteux réactivité vasculaire cérébrale, nous avons testé un mécanisme contribuant à l’autorégulation compromise en mesurant une réponse dilatoire myogène à pression intravasculaire réduite ex vivo dans isolé et sous pression rongeurs MCA segments (Figure 1) provenant de rats soumis à bTBI doux à l’aide d’un modèle de tube de choc avancé Blast Simulator (ABS) (Figure 2 et Figure 3) (voir Rodriguez et al.,³⁹ Le tableau 1) qui utilise l’air comprimé envoyée directement à une chambre de pilote pour générer de Freidlander-comme⁴⁰ au-dessus et sous pression de vagues (voir Rodriguez Al³⁹Figure 1A).

Figure 1 : Emplacement des artères cérébrales moyennes (ACM). Vue ventrale du cerveau rat mettant en valeur l’emplacement de la MCA relatifs aux artères cérébrales postérieures (PCA), les artères carotides internes (ICA), artères carotides externes (CEA), artère basilaire (BA) et artères carotides communes (CCA). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Advanced dispositif de tube de choc Blast Simulator (ABS). L’ABS utilisé pour produire des lésions primaires souffle chez tous les animaux de l’étude. 1 = chambre de pilote ; 2 = vase d’expansion ; 3 = chambre de spécimen ; 4 = suppresseur de l’onde réfléchie ; étoile jaune = plateau de spécimen. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’University of Texas Medical Branch, une Association pour évaluation et accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC) accrédités par l’installation. 1. animale préparation pour blessure ABS Blast Mettre en marche le ventilateur mécanique volume rongeurs et fixer des taux de respiration entre 40 – 45 respirations par minute. Interrupteur thermostatique contrôlée réchauffement couverture ON et tape un pad bleu dessus. Fixez le tuyau de ventilation au ventilateur. Recueillir de traîneau de l’intubation endotrachéale, laryngoscope, plongeur long pincettes, stylet, tube endotrachéal et un tampon de coton imbibé de 0,05 mL de 1 % lidocaïne HCl. organiser sur le pavé bleu. Confirment que les rongeurs anesthésique « bubble » chambre, ventilateur, chambre à air et isoflurane chambre tuyaux est solidement connectés et attachés à leur fiche respective ou de la prise. La pince de la chambre à bulles anesthésique doit être ouvert ; la pince du ventilateur doit être fermée. Sur la chambre à air, réglez le bouton pour l’air ambiant à 2 L/min et le bouton pour l’oxygène à 1 L/min. Allumez l’isoflurane et réglez le bouton à 4 % du mélange de volume. Lancer une horloge et placer un jeune adulte (≈3 mois), le rat Sprague-Dawley mâle (350 – 400 g) dans la chambre à bulles anesthésique pendant 4 à 6 min. Pèsent rat à la marque de 2 min. Confirmer le rat est complètement anesthésié en pinçant doucement les orteils de la patte arrière. Si aucun retrait de patte n’est observée, réduire l’air ambiant et programmez sur 1 L/min, oxygène à 0,4 L/min et isoflurane à 2 % du mélange de volume. Mettez un téléthermomètre rectale température moniteur. Ouvrez la pince au ventilateur et fermer la pince à la chambre à bulles anesthésique. Retirez rat de chambre à bulles anesthésique et position sur le traîneau de l’intubation endotrachéale. Intuber rat. Placer laryngoscope dans la bouche de l’animal, utiliser des pinces plongeur long pour positionner la languette de la route, écouvillon coton imbibé de lidocaïne embout long à l’intérieur de la gorge et insérer délicatement son stylet contenant la sonde endotrachéale dans la trachée du rat. Une fois intubé, insérer l’extrémité du tuyau ventilateur sur l’extrémité extérieure du tube endotrachéal et observer et confirmer que le rat respire sans cesse et sans difficulté. Arrimage du tube endotrachéal en place en prenant soin que la langue est exempt de nœud. Appliquer la gelée de pétrole blanche un téléthermomètre rectale de la sonde et insérer juste en dessous de la queue. Retirez le bac de spécimen d’ABS de la chambre de spécimen et placer sous la lampe chauffante pour réchauffer avant le placement de rat sur le plateau. Raser le sommet de crâne de rat commence au-dessus des yeux et vers le bas à entre les oreilles. Couper un bouchon d’oreille de taille standard mousse en moitiés identiques avec des ciseaux. Commencez au centre de la base de la fiche et couper tout droit jusqu’à la pointe arrondie. Insérez un morceau coupé en deux dans chaque embout tout d’abord le long du canal de l’oreille jusqu’à ce que le contact est établi avec la membrane tympanique. Surveiller la température rectale. Après avoir atteint une température de 37 ° C, le rat est prêt à être chargé dans le bac de spécimen d’ABS. Fixez le rat sur le plateau de spécimen d’ABS. Retirer le tuyau de ventilation de la sonde endotrachéale et rapidement mais doucement glisser le rat dans l’extrémité supérieure de la barre d’État, guidant doucement la tête à travers le support de tête d’ouverture et le manchon en caoutchouc. Replacer le tuyau de ventilation de nouveau dans la sonde endotrachéale, vérifier le manchon en caoutchouc pour s’assurer que c’est bien, mais pas serré autour du cou et vérifier que le rat est la pose dans une position couchée latérale (Figure 3). Désactiver l’isoflurane et retirer le tuyau de ventilation de la sonde endotrachéale. Verrouiller et sécuriser le plateau de spécimen ABS contenant le rat anesthésié dans la chambre de spécimen d’ABS. Doucement pincement postérieur patte orteils à l’aide de longues pinces à épiler toutes les 3 s jusqu’à ce qu’une réponse réflexe de retrait est obtenue. 2. préparation du dispositif ABS Blast et Induction de Blast-TBI Remarque : Étapes de protocole 2.1 – 2.10 généralement terminées en même temps que les étapes 1.1 – 1,22 donc l’ABS est prêt pour le droit de l’administration des blessures souffle après que le rat est chargé et verrouillé dans la chambre de spécimen. Desserrez le bouton de la pompe (Figure 4A) hydraulique à main afin de permettre tout évacuer l’air résiduel pour échapper de la chambre de pilote (Figure 4B) et desserrer la chambre de son sceau. Desserrer les écrous (Figure 4C) depuis les barres all-fil (Figure 4D) entourant la chambre pilote et glissez la chambre vers la gauche et loin de la chambre d’expansion (Figure 4E). Supprimer complètement les deux tiges de tous les threads et leurs écrous borgnes correspondant situés en haut de la chambre de pilote afin de permettre le placement des feuilles mylar entre le pilote et le vase d’expansion. Pile et la bande ensemble le long de la coupe avant de bord supérieur quatre et pré-dosés (longueur 30 cm, largeur 20 cm, épaisseur 0,004 po) des feuilles de mylar (formant une mylar « membrane ») à l’aide d’un morceau de 2,54 cm de ruban-cache. À l’aide d’un deuxième morceau de ruban, ruban solidement le bord supérieur de la membrane mylar vers le haut de la chambre d’expansion et au centre de l’ouverture entre les pilote et l’expansion chambres (Figure 4F). Fixez la chambre pilote contre la membrane mylar en remplaçant les deux tiges de threads tout en haut de la chambre et le serrer à la main tous les écrous borgnes entourant la chambre. Situer l’accessoire lingot d’acier contre le main hydraulique pompe bloc et pilote la chambre jusqu’à monter en toute sécurité. Serrez le bouton de pompe hydraulique à main et confirmer que la chambre pilote reste sous pression sans fuites en observant un seuil de pression constante sur le manomètre hydraulique. Ouvrez le fichier acquisition de déclencheur qui enregistre ABS souffle appareil pression des traces sur l’ordinateur de périphérique de blast ABS. Desserrer (Figure 4G) bouton principal l’air comprimé du réservoir assez légèrement ouvrir les voies respiratoires. Fonctionner la pompe hydraulique à main jusqu’à ce que l’indicateur de jauge atteigne la flèche rouge indique un niveau de pression de chambre désiré de ≈5, 000 lb/po2. Sécuriser et positionner l’animal anesthésié sur le plateau de spécimen d’ABS (Figure 4H) dans une position couchée latérale (Figure 3) et verrouiller le tiroir de l’échantillon dans la chambre de spécimen d’ABS (Figure 4j’ai). Un hind délicatement pincée sa patte à l’aide de longues pinces à épiler toutes les 3 s jusqu’à ce qu’une réponse réflexe de retrait est obtenue. Cliquez sur Démarrer dans la page d’acquisition ouvert sur l’ordinateur de périphérique de blast ABS. Une fois la fenêtre « Acquerir » apparaît sur l’écran, appuyez sur et maintenez la gâchette de dispositif ABS souffle jusqu’à ce que l’explosion s’éteigne, une rupture de la membrane mylar et l’administration de la blessure de blast ABS (20,9 lb/po² ±1.14, 138 kPa ±7.9) pour le rat. Juste après que l’explosion fait exploser, lancer une deuxième horloge afin de garder une trace de combien temps (en min et s) écoulé après l’accident. Enlever le rat du plateau de spécimen d’ABS et revenir au bleu coussin et couverture de réchauffement de la planète, plaçant complètement sur son dos pour évaluation de répression réflexe de redressement. Enregistrer l’heure de retour du réflexe de redressement. Observant la deuxième minuterie, document en min et s la longueur de temps en temps après l’accident qu’il faut pour le rat à rouler du dos sur le ventre trois successive. Retourner le rat à la chambre à bulles anesthésique. Desserrez le bouton de pompe hydraulique à main afin de permettre aux pilote chambre desserrant et en mouvement. Serrez le bouton principal du réservoir d’air comprimé afin de fermer les voies respiratoires. Figure 3 : Placement de rat sur le plateau de spécimen d’ABS et à l’intérieur de l’ABS Direction et l’orientation de l’animal de l’étude à l’intérieur de l’ABS. Lorsqu’il est placé dans l’ABS, l’animal est dans une position couchée transversale avec la surface dorsale de la tête perpendiculaire à la direction de l’onde de choc (flèches rouges). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Dispositif de tube de choc avancé Blast Simulator (ABS) schématique. Principaux composants de l’ABS. A = pompe à main hydraulique ; B = chambre de pilote ; C = écrous borgnes ; D = all-thread tiges ; E = vase d’expansion ; F = emplacement du placement de mylar de membrane ; G = bouteilles d’air comprimé ; H = bac spécimen ; J’ai = chambre de spécimen. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 3. préparation de la Solution PSS de rongeurs MCA Remarque : Protocole étapes 3.1 – 3.3 généralement terminées en même temps que les étapes 1.1 – 1,22 pour avoir la solution PSS est prêt à l’emploi. Préparer et mélanger une solution saline physiologique de 1 000 mL (PSS) de la composition et les concentrations suivantes : 130 mM NaCl ; 4,7 mM KCl ; 1,17 mM MgSO4∙7H2O ; glucose 5 mM ; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3. Equilibrer le PSS avec un mélange de gaz de 21 % O2 et 5 % de CO2 dans un équilibre de N2. La solution est prête lorsque le pH lit 7,4.Remarque : Tous les gaz sont obtenus à partir de bouteilles de gaz comprimé dans les concentrations mentionnées ci-dessus. Remplir les bouteilles de réservoir et la tubulure avec solution PSS préparée et réfrigérer le reste de la solution. 4. extraction de Segments de rongeurs MCA Après documentant la longueur du temps réflexe de redressement, retourner le rat à la chambre à bulles anesthésique. FERMER la pince au ventilateur et ouvrez la pince à la chambre. Tourner l’isoflurane sur 4 % de mélange de volume et de garder le rat dans la chambre pour 2-3 min jusqu’à ce que profondément anesthésiés. Une fois que le rat est anesthésié, ouvrir la pince au ventilateur et fermer la pince à la chambre à bulles anesthésique. Réduire l’isoflurane à 2 % du mélange de volume et lui retirer la chambre à bulles. Le placer sur le ventre sur la couverture de réchauffement de la planète et ré-insérer l’extrémité du tuyau ventilateur sur l’extrémité extérieure du tube endotrachéal. Maintenir une ventilation mécanique à une fréquence respiratoire entre 40 – 45 respirations par minute et en anesthésie à 2 % du mélange de volume pendant 30 ou 60 min immédiatement les blessures post-bTBI. Après achèvement de soit le 30 ou 60 min temps de survie, augmenter l’isoflurane à 4 % du mélange de volume et profondément anesthésier pour 5 à 6 min. immédiatement euthanasier par décapitation à l’aide d’une guillotine de rongeurs spécifiques.Remarque : Dans ces expériences, nous avons gardé les animaux anesthésiés et sous ventilation mécanique après le retour de redressement réflexe jusqu’à la décapitation. Si l’étude nécessite une plus longue survie porté, analgésiques devraient être administrés à l’animal avant l’émergence de l’anesthésie. Enlever délicatement le cerveau du crâne. Utilisez une lame de bistouri #10 pour pratiquer une incision centrale, vertical, os de profondeur 1.5 pouce du haut du cuir chevelu rasé vers le bas pour le condyle occipital. Pinces-gouges petit os permet d’ouvrir et séparer la peau du cuir chevelu de l’os du crâne. Pinces-gouges grand OS permet de couper et extraire l’occipital, interpariétales et la moitié inférieure de l’os frontal recouvrant le cerveau. Utilisez une spatule chirurgicale pour creuser soigneusement le cerveau hors du crâne, une fois que le cerveau est gratuit autour d’OS.Remarque : Prendre des précautions extrêmes quand qui sépare le cerveau du crâne alors que pour ne pas inutilement remorqueur, jerk, ou tirez le MCA délicat des segments de la paroi crânienne. Déposer le cerveau récolté dans la solution PSS réfrigérée contenue dans un petit verre de pétri qui repose directement sur un bloc de glace solid. Enlever avec précaution tant le début de MCA de gauche et de droite dans le cercle de Willis. Toujours enlever le segment latéralement et dorsalement pour environ 4 à 5 mm. Nettoyer délicatement les segments MCA recueillies d’environ 4 à 5 mm de longueur de n’importe quel tissu conjonctif utilisant micropinces. Monter de la MCA sur l’arteriograph. Cathétériser l’extrémité proximale de chaque segment avec la première micropipette de verre (diamètre ≈70 µm) et fixer avec une suture de nylon de 10-0. Doucement perfuse le lumina avec PSS pour enlever les résidus de sang et d’autres contenus de la lumière. Canule dans l’extrémité distale de chaque segment avec la deuxième micropipette sans étirer le segment MCA et fixer avec une suture de nylon de 10-0. Après le montage réussi du segment MCA, placer la chambre au sommet de la scène du microscope inversé pour le grossissement des vaisseaux. Le microscope est équipé d’une caméra vidéo, moniteur et un scaler vidéo calibré avec un micromètre optique pour mesures de diamètre artériel. Remplir chaque segment et le bain d’arteriograph environnantes avec PSS diffusé continuellement chauffé depuis la température ambiante à 37 ° C et équilibrée avec le mélange de gaz de 21 % O2 et de 5 % de CO2 dans un équilibre de N2. Equilibrer les segments MCA à une pression de 50 mmHg pendant 60 min en soulevant les bouteilles réservoir reliés aux micropipettes à une hauteur appropriée ci-dessus les segments. Transducteurs de pression situés entre les micropipettes et bouteilles de réservoir permettra d’évaluer la pression transmurale dans le segment MCA qui indique quand la pression 50 mmHg est atteint. À l’issue de la période de l’équilibration, augmenter la pression intravasculaire à 100 mmHg en définissant les bouteilles de réservoir à différentes hauteurs. Livrer les 30 mM K+ (pour la confirmation de la contraction de navire) via le perfusat luminal et mesure diamètre artériel. Environ 10 min plus tard livrer 10-5 M d’Ach (pour la dilatation de vaisseau) et mesurer les diamètres artériels. Examiner les réponses dilatoires de navire. Abaissez les bouteilles de réservoir pour réduire la pression intravasculaire de 100 mm de Hg à 80 mmHg. Laissez les segments MCA s’équilibrer pendant 10 min. diamètres artériels de mesure. Réduire la pression intravasculaire de 80 mmHg à 60 mmHg. Laissez les segments MCA s’équilibrer pendant 10 min. diamètres artériels de mesure. Réduire la pression intravasculaire de 60 mmHg à 40 mmHg. Laissez les segments MCA s’équilibrer pendant 10 min. diamètres artériels de mesure. Réduire la pression intravasculaire de 40 mmHg à 20 mmHg. Laissez les segments MCA s’équilibrer pendant 10 min. diamètres artériels de mesure.

Representative Results

Surpression bTBI moyenne pour tous les animaux de l’étude a été ±1.14 de 20,9 lb/po2 (138 kPa ±7.9). La durée moyenne de la suppression du réflexe (RR) pour les rats soumis à une exposition de shockwave bTBI ABS (5,37 min ±2.1) de redressement n’était pas significativement plus longue (p = 0,36, bTBI vs sham) que dans le groupe fictif (5,10 min 1,6). Dans les 30 et 60 min sham anglophones, diamètres MCA augmenté au-dessus de référence que la pression intraluminale est passée de 100 à 20 mmHg. Par rapport à leurs groupes de sham correspondants, les réponses dilatoires de MCA à la continu imposé la réduction pression intravasculaire dans les 30 min observée (p = 0,01, bTBI vs sham) et 60 min (p = 0,02, bTBI vs sham) ABS bTBI groupes étaient considérablement réduit après l’exposition souffle (Figure 5). Pour une discussion plus détaillée de ces résultats, voir Rodriguez et al.,39. Ces études ont révélé que doux bTBI réduite significativement les réponses cérébrales dilatateur compensatoire à pression intravasculaire réduite dans les segments MCA 30 et 60 min après bTBI doux tandis que les niveaux de doux des ondes de choc utilisées dans ces études a donné lieu à des durées de suppression des RR (< 30 s) semblables à ceux des rats sham-blessés. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel. La réponse myogénique aux changements de pression intravasculaire a été évaluée en calculant le pourcentage de changement de ligne de base (100 mmHg) pour chaque niveau de la pression intraluminale (20, 40, 60 et 80 mmHg). T-tests de l’étudiant non-appariés ont servi à évaluer les différences entre des lignes de base de groupe bTBI et sham. Différences dans les réponses de dilatateur MCA entre groupes bTBI et sham ont été évalués en utilisant le test de comparaisons multiples d’un Dunnett répétées analyse de variance (ANOVA) et test de Bartlett, un pour la variance égale. En raison de la réduction de puissance statistique qui résulte de tests répétés, des comparaisons à chaque point de pression spécifique dans le MCA expériences (p. ex., entre 100 et 80 mmHg ou entre 60 et 40 mmHg, etc.) n’a été effectuée. Signification a été acceptée à la p ≤ 0,05 niveau. Toutes les données dans le texte, la table référencée et la figure est exprimée comme moyen ± erreurs-types des moyens (SEM). Figure 5 : Effets de bTBI sur artère cérébrale moyenne (MCA) réponses à une pression réduite intravasculaire. Dilatateur réponses à pression intravasculaire des réductions progressives ont montré des réponses vasodilatatrices avec facultés affaiblies et ont été significativement réduits dans les 30 min (p = 0,01, bTBI vs sham) et 60 min (p = 0,02, bTBI vs sham) bTBI groupes (n = 6/groupe) après l’exposition de souffle par rapport aux deux groupes de Sham (n = 12). Dans les 30 et 60 min sham anglophones, diamètres MCA augmenté au-dessus de référence que la pression intraluminale est passée de 100 à 20 mmHg. Valeurs sont reportées comme moyen ± SEM. *p < 0,05 vs sham. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Comme avec tous les protocoles et les instructions, il est impératif que certaines étapes pour le protocole de cette étude sont suivis aussi précise et aussi précisément que possible. Après l’intubation initiale du rat, il est important de confirmer qu’il respire sans cesse et sans difficulté. Insertion par erreur la sonde endotrachéale dans le œsophage au lieu de la trachée se traduira par râpage, respirations difficiles, des saignements et le vibrant subséquente du rat déficient livraison anesthésique jusqu’aux poumons.

Lors de l’enregistrement les feuilles de membrane mylar au-dessus du centre de l’ouverture entre la chambre de pilote et d’expansion, il est impératif que les feuilles sont centrés et couvrent toute l’ouverture³⁹^,⁴¹. Faire les feuilles au-dessus de l’ouverture se traduira par des fuites d’air de la chambre de pilote, une baisse de la pression requise pour rafale-potentiel de membrane et la négation de l’administration de la blessure de l’explosion. Situer correctement et solidement mise en place du lingot d’acier accessoire contre la pompe hydraulique à main bloc et pilote la chambre est également essentielle car se resserre la poignée de pompe hydraulique à main et confirmant la chambre pilote reste sous pression sans fuites. Un placement correct du bloc en acier permet à la chambre de pilote de fermer solidement contre le vase d’expansion, créant ainsi le joint obligatoire requis au-dessus de la chambre d’ouverture par les feuilles de membrane Mylar et entre le pilote et expansion la chambre.

Lors de la préparation avant les extractions de navire MCA, gazage le PSS avec le mélange requis de 21 % O₂ et 5 % de CO₂ dans un équilibre de N₂ s’équilibre la solution et facilite la nécessitée neutre pH physiologique nécessaire pour une travaillant PSS solution²¹^,³³^,³⁴.

Équilibration des segments à une pression constante pour 60 min²¹^,³²^,³³^,³⁴ est extrêmement obligatoire car cette étape permet les segments constriction suit qu’une dilatation maximale affichée pendant leur première pressurisation primaire. Cet événement démontre la présence de ton spontané, une propriété évocateur d’une artère saine³²^,³³^,³⁴. Bien que les niveaux de pression assortis pour l’équilibration du segment ont été utilisés dans d’autres études³³^,³⁴^,⁴², cette étude et celles de Mathew Al.²¹, Golding et coll.³⁵ et Golding et coll.⁴³ équilibrés les segments à 50 mmHg. Tandis qu’équilibration a recueilli segments n’importe où entre 40 mmHg à 100 mmHg³² permet une certaine souplesse et de la modification pour cette étape du protocole, une période d’équilibration heures au sein de ces paramètres de pression confirme finalement en bonne santé artères nécessaires à la poursuite de l’expérience.

Prenant très prudent lorsque vous retirez le cerveau du crâne et les segments MCA de gauche et de droite depuis le cercle de Willis tout en conservant les navires est peut-être l’étape la plus critique de l’ensemble du protocole. Perforant le cerveau avec l’OS pinces-gouges, déchirure ou sévères qui s’étend des segments au moment du retrait ou tirant accidentellement sur les vaisseaux avec la spatule chirurgicale lorsque vous creuser le cerveau hors du crâne se traduira en fin de compte dans la destruction de la récolte MCA, causant des segments inutilisables et abandonné l’utilisation de cet ensemble des artères, miction en fin de compte l’expérience entière pour cet animal.

Bien que mesurant une réponse vasculaire cérébrale des stimuli dilatoire ou constrictory par la MCA segments ex vivo recueillis après impact ou blast TBI in vivo a permis le succès, la méthode n’est pas sans ses difficultés et/ou limitations. Peut-être l’un des plus discernables complexités liées à examiner les conséquences du TBI sur la circulation de la vascularisation cérébrale se détache les effets explicites du TBI sur les vaisseaux des effets implicites encourus en raison des divers matériaux et éléments générés par le cerveau lésé⁴⁴. Cette perplexité concevable peut potentiellement être contournée par l’analyse ex vivo les réactions vasoconstrictrice et vasodilatatrices des récoltées, perfusés et/ou pressurisé de MCA. Pour tenter de réduire la durée pendant laquelle les artères cérébrales in vivo sont exposés localement déchargé parenchymateuse vasoactif matériel avant son décès, collection des artères cérébrales directement après le TBI peut diminuer le degré d’une telle exposition prolongée effets. Ex vivo études sur de MCA isolé en outre présenter la perspective de l’analyse des mécanismes du traumatisme vasculaire grâce à l’utilisation des antagonistes et agonistes des récepteurs particuliers ou véhicules réputés de lésion vasculaire qui ne donnerait pas un examen comme efficacement ou comme discriminatoire en vivo. Par la suite, cela ex vivo méthode combinable avec ex vivo exposition aux drogues pour tester les réponses myogènes qui en résulte (vasoconstriction ou dilatation du segment du navire en raison de l’exposition au médicament intravasculaire ou extravasculaire).

Autres restrictions touchent à peu près ou avec impatience retirer de la MCA le cerveau récolté, ce qui peut entraîner un déchirement prématuré des vaisseaux, annulant ainsi leur utilisation. En outre, laissant plus de quelques minutes s’écoulent entre l’euthanasie de l’animal, collection des navires et leur placement dans la solution ainsi préparée PSS peut aussi réduire à néant leur viabilité. Bien réalisée et suivie, les méthodes décrites dans le présent protocole pour tester les réponses myogènes de MCA après que bTBI prend plusieurs heures de bout en bout et réduisant la longueur du temps nécessaire pour réussir les essais peuvent entraîner dans experimental panne. Toutefois, cette méthode se faite in vitro et utilise beaucoup plus rentable instrumentation et équipement than in vivo par résonance magnétique à haute résolution (MR) d’imagerie⁴⁵^,⁴⁶ ou écho-Doppler conventionnel / techniques velocimetric⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹ qui sont également employés pour des études de navire.

Ces constatations que bTBI légère blessure est associé ayant une déficience cérébrales réponses dilatoires à pression intravasculaire réduite pourraient être une fonction du vasospasme⁶^,⁷ et CMLV hyperconstriction⁵⁰ rapportés après que exposition souffle conduisant finalement à des événements tels que réduit perfusion cérébrale relative. En outre, lésion induite par l’explosion, entravant les réactions normales de dilatoires de la vascularisation cérébrale pourrait éventuellement favoriser la poursuite des réductions en perfusion cérébrale lorsqu’il est combiné avec hypotension artérielle, une incidence fréquente au cours des opérations de combat.

Ces résultats indiquent que bTBI entraîne un changement aux mécanismes facilitant le contrôle vasculaire artériel. Si atteinte vasculaire cérébrale phase aiguë réponse myogénique artérielle aux réductions de pression intravasculaire au moins une blessure après heure ont été observées, il reste des lacunes dans l’information entourant la phase aiguë après bTBI. L’importance d’identifier quelles blessures de déficiences physiques et biochimiques de la vascularisation cérébrale et l’exposition de cerveau aux bTBI causes pourraient aider à déterminer le niveau de succès thérapeutiques et/ou de réadaptation assez immédiatement après la blessure.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Études ont été réalisées dans le cadre d’une équipe appuyée par le projet de Moody translationnelle Traumatic Brain Injury Research et prix W81XWH-08-2-0132 de l’US Army Medical Research and le Material Command – département de la défense.

Materials

Advanced Blast Simulator (ABS)	Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc.	N/A	Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries
Adult, male, Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	N/A	Experimental animals
Arteriograph	Living Systems Instrumentation, Inc.	Arteriograph	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Bone rongeurs, large	FST Fine Science Tools	Friedman Rongeur	Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small	FST Fine Science Tools	Boynton Rongeur	Brain extraction from skull
CaCl₂	Sigma	Calcium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs	3M	Foam Ear Plugs 1100 Class AL	Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine
Glucose	Sigma	D-[+]-Glucose	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	Isoflurane, USP	Anesthetic
KCl	Sigma	Potassium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO₄•7H₂O	Sigma	Magnesium sulfate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps	Buxton Biomedical Inc.	Micro Tying Fcps, 180mm	Brain extraction from skull
Mylar sheets	Texas Art Supply	Mylar	Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl	Sigma	Sodium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO₃	Sigma	Sodium bicarbonate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture	Ethicon	10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm)	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Scalpel blade #10	Bard-Parker	10 Stainless Steel Surgical Blade	Brain extraction from skull
Surgical spatula	Delmaks Surgico	Cement Spatula	Brain extraction from skull
Thermometer	Physitemp Instruments, Inc.,	Thermalert Monitoring Thermometer	Monitoring of experimental animal's core body temperature
Volume ventilator	Harvard Apparatus, Inc.	Small Animal Ventilator	Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket	Gaymar Industries, Inc.	Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad	Maintenance of experimental animal's body temperature

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Citer Cet Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).