Summary

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

Abstract

Telomeres는 복사할 수, 반복 포함 하는 긴 noncoding RNAs (테라), telomeric를 야 기한는 telomere 생물학, telomere 길이 항상성 섬으로 형성 등 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 최근 연구 결과 밝혀 테라 분자도 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 유전자 발현을 조절 하기 위해 내부 염색체 영역 상호 작용. 이 증거에 따라 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 하위 집합으로 나타났습니다 테라의 성적표는 염색체 끝에 지역화. 테라 분자의 역학의 더 나은 이해는 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다. 여기, 우리 고 MS2 GFP 시스템을 사용 하 여 암 세포에서 단일 telomere 테라 성적표를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 목표에 선물이 안정적인 클론을 생성 하는 프로토콜 MS2 시퀀스에서 단일 subtelomere 통합을 포함 하 AGS 인간 위 암 세포 라인을 사용 하 여. MS2 태그 telomere에서 테라의 전사 (MS2-GFP) GFP 융합 MS2 RNA 의무적인 단백질의 공동 식 시 라이브 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 시각 MS2 태그 테라 분자의 표현을 결과입니다. 이 방법은 수 연구원은 암 세포에서 단일 telomere 테라 분자의 역학을 공부 하 고 다른 셀 라인에 적용 될 수 있습니다.

Introduction

긴 noncoding RNA 테라 염색체의 subtelomeric 지역에서 복사할 및 그것의 녹음 방송 종료 telomeric 반복로1,2내 염색체 끝을 향해. 이러한 이유로, 테라 사본 그들의 5′ 끝에 subtelomeric 파생 시퀀스의 구성 하 고 telomeric 반복 (척추 동물에 UUAGGG)3종료. 역할 제안 되었습니다 테라,7,8 끝 telomeres4,5, DNA 복제6, 염색체 가운데 동종 재결합을 추진에서 섬으로 형성을 포함 하 여 중요 한 , 9, telomere 구조10및 telomere 길이 항상성2,11,,1213통제. 또한, 테라 성적표 마우스 배아 줄기 (ES) 세포14에 광범위 한 유전자 발현 조절에 수많은 extratelomeric 사이트와 상호 작용 합니다. 이 맞춰 증거, RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 테라 성적 하위 집합 나타났습니다 telomeres1,,215에서 지역화 합니다. 또한, 테라 폼 핵 집계 마우스 세포2,16에서 X와 Y 염색체에서 지역화를 보고 되었습니다. 이러한 연구 결과 테라 성적표는 핵 내에서 복잡 한 역학 받아야 나타냅니다. 테라 분자의 역학을 이해 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다.

MS2 GFP 시스템은 다양 한 유기 체17,18에서 살아있는 세포에서 RNA 분자를 시각화 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이 시스템은 이전 태그를 S. cerevisiae12,19에서 단일 telomere 테라 분자 시각화 사용 되었습니다. 이 시스템을 사용 하 여, 최근에 보였다는 효 모 테라 성적표 지역화 세포질 내 게시물-diauxic 이동 단계 동안 테라 extranuclear 기능20발휘 수 있습니다 제안. 최근 암 세포21단일 telomere 테라 성적표 공부 MS2 GFP 시스템을 사용 했습니다. 이 목표를 우리 MS2 시퀀스는 단일 telomere (telomere 15q,이 하 Tel15q)에 통합 하는 CRISPR/Cas9 게놈 편집 도구를 고용 하 고 얻은 MS2 태그 내 생 Tel15q 테라 (테라 MS2 클론)을 표현 하는 클론. 인식 하 고 생활에 단일 telomere 테라 성적 MS2 RNA 시퀀스 수 시각화를 바인딩합니다 MS2 RNA 바인딩 GFP 융합 단백질 (MS2-GFP)의 공동 식21세포. 여기 설명 하는 프로토콜의 목적은 테라 MS2 클론의 생성에 필요한 단계를 자세히 설명 하는 것입니다.

테라 MS2 클론을 생성 하려면 MS2 카세트 telomere 15q의 subtelomeric 지역 통합은 테라 발기인 지역 및 전사 시작 사이트의 다운스트림. MS2 카세트 lox p 사이트에 의해 형벌 네오 마이 신 저항 유전자를 포함 하 고 subtelomere 15q에의 통합 CRISPR/Cas9 시스템22를 사용 하 여 수행 됩니다. 카세트, 단일 클론 MS2의 transfection 선택 후 카세트의 subtelomeric 통합 PCR에 의해 확인 된다 DNA 시퀀싱 및 남쪽 오 점. 긍정적인 복제품만 MS2 시퀀스 및 subtelomere 15q에 단일 lox p 사이트는 카세트에 선택 표시를 제거 하려면 Cre 표현 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Tel15q에서 MS2 태그 테라 성적 표현의 실시간 정량 Pcr에 의해 확인 됩니다. 마지막으로, MS2 GFP 융해 단백질은 표현 형광 현미경 검사 법에 의해 MS2 테라 성적표를 시각화 하기 위해 retroviral 감염을 통해 테라 MS2 클론에. 테라 성적표 RNA 물고기에 의해 쉽게 검출 될 수 있다 고 반복 전용 telomeric를 사용 하 여 라이브 셀 이미징 프로브1,2,,1523. 이러한 접근에는 단일 셀 해상도에서 테라 분자의 전체 인구의 지역화에 대 한 중요 한 정보가 나와 있습니다. 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스를 포함 하는 클론의 세대에는 단일 telomere 테라 성적 기능과 테라의 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다 살아있는 세포에서의 역학을 공부 하는 연구자 수 있게 된다.

Protocol

1입니다. 네오 마이 신 내성 클론의 선택 햄의 F-12_K (Kaighn) 매체와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 37 ° C, 5% CO2보충에 AGS 세포 성장. SgRNA/Cas9 벡터와 MS2 카세트 1시 10분에 표현 된 50-60% 합류에 셀 transfect 어 금 니 비율21.참고: 병렬 실험에서 GFP 표현 벡터 (즉, Cas9-GFP 벡터) transfecting 여 trans…

Representative Results

그림 1 실험적인 전략의 개요를 나타냅니다. 프로토콜 및 AGS 셀에서 테라 MS2 클론의 세대를 위한 나타내는 타임 라인의 주요 단계 (그림 1A) 표시 됩니다. 1 일에서 6 잘 플레이트의 여러 우물 MS2 카세트와 sgRNA/Cas9 (참조 그림 1B) 벡터 표현 페는. 2 개의 다른 subtelomere 15q 전?…

Discussion

이 문서에서 우리는 subtelomere 15q 통합 MS2 시퀀스를 포함 하는 인간의 암 세포 클론을 생성 하는 방법을 제시. 이러한 클론을 사용 하 여, subtelomere 15q에서에서 복사할 MS2 태그 테라 분자 MS2 GFP 융해 단백질의 공동 식으로 형광 현미경 검사 법에 의해 검색 됩니다. 이 방법은 단일에서 표현 하는 테라의 역학을 공부 하는 연구자 수 생활에서 telomere21세포. 이 프로토콜에서 테라 MS2 클?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 Trento의 대학에 CIBIO의 고급 이미징 시설 및 비엔나에서 BioOptics 빛 현미경 시설 최대 F. Perutz 실험실 (MFPL)에서 직원에 게 감사. 이러한 결과 연구는 기금을 받았다 Mahlke Obermann 재단 및 연구, 기술 개발 및 실증에 대 한 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램에서 부여 계약 없음 609431 적에 EC는 이탈리아 정부 대학 교육 및 연구 (MIUR)에서 리 타 레비 Montalcini 친교에 의해 지원 됩니다.

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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Citer Cet Article
Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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