대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포¹에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ‘ 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간^2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포^{4,,56,7 ,8}. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5′ LTR 억압 고 에이즈 식^{9,10,11,,1213}의 활성화. 그러나 Ex vivo^14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.

에이즈 식 비효율적인 접합¹⁶ 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)¹⁷의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.

여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3′ 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장¹⁸아미노산 38에 레 브의 2^nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브^NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.