Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen
Summary
Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.
Abstract
HIV bleibt aufgrund der Existenz eines Reservoirs von Zellen, die stabil und latente Form des Virus, birgt für das Immunsystem unsichtbar bleibt und nicht durch die aktuelle antiretrovirale Therapie (cART) unheilbar. Transkription und Spleißen wurden gezeigt, HIV-1 Latenzzeiten in ruhenden CD4 + T-Zellen zu verstärken. Umkehrung der Latenz durch den Einsatz von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) in der “Shock and Kill” Ansatz wurde ausgiebig untersucht, in dem Versuch, dieses Reservoir zu bereinigen, aber keinen Erfolg in klinischen Studien wegen mangelnder Entwicklung von angemessenen kleinen bisher nicht nachgewiesen Moleküle, die effizient dieses Reservoir durcheinanderbringen können. Die hier vorgestellten Protokoll stellt eine Methode zur zuverlässig und effizient Bewertung Latenz Umkehr Agents (Gebietskörperschaften) auf HIV Transkription und Spleißen. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung von ein LTR-gesteuerte dual Color-Reporter, der gleichzeitig die Wirkung von einem LRA auf Transkription und Spleißen messen kann durch Durchflusszytometrie. Das hier beschriebene Protokoll ist ausreichend für adhärente Zellen als auch die Zellen in der Suspension. Es eignet sich für eine große Anzahl von Drogen in einem hohen Durchsatz-System testen. Die Methode ist technisch einfach zu implementieren und kostengünstig. Darüber hinaus ist die Verwendung der Durchflusszytometrie ermöglicht die Beurteilung der Zellviabilität und somit Drogen Toxizität zur gleichen Zeit.
Introduction
Trotz wirksame langfristige antiretrovirale Therapie besteht HIV in einem latenten Zustand als eine integrierte Provirus im Speicher CD4 + T-Zellen-1. Das Chromatinstruktur des HIV-1-5 “lange terminal Repeat (LTR) Promoter und epigenetische Modifikationen wie Histon-Methylierung und Deacetylation durch DNA-Methyltransferasen (DNMT) und Histon Deacetylases (HDAC) sind wichtige Mechanismen, die transcriptional Repression und damit nach Integration Latenz2,3. Eine Vielzahl von Latenz Umkehr Agenten (Gebietskörperschaften) wurde untersucht, auf ihre Wirksamkeit induzieren Virus Produktion in-vitro- und in-vivo von latent infizierten ruhenden CD4 + T Zellen4,5,6,7 ,8. Unter den lokalen und regionalen Gebietskörperschaften getestet, HDACi (HDAC-Inhibitoren) und BET Bromodomain-Hemmer (BETis) induzieren Chromatin Enttauung und Freisetzung von positiven Transkription Dehnung Faktor b (P-TEFb) bzw., was zu nachfolgenden entlasten die transkriptionelle Repression auf die 5′ LTR und Aktivierung von HIV Ausdruck9,10,11,12,13. Das Ausmaß der Reaktivierung durch diese Gebietskörperschaften erreicht war jedoch begrenzt, da nur ein mäßiger Anstieg der Zelle-assoziierten unspliced HIV mRNA (uns RNA), bezeichnend für virale Transkription, ex Vivo14,15beobachtet wurde. Wichtig ist, versäumt diese lokalen und regionalen Gebietskörperschaften auch, eine Verringerung der Häufigkeit von latent infizierten Zellen induzieren.
HIV-Ausdruck kann weiter durch ineffiziente Spleißen16 sowie Mängel im nuklearen Export mehrfach gespleißte HIV-RNA (MS-RNA)17beschränkt sein. Daher sind zur Identifizierung neue Klassen von lokalen und regionalen Gebietskörperschaften, die sind stärker und können Einfluss auf verschiedene Aspekte der Virus Produktion Post-Integration erforderlich. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen Assays, die helfen, definieren die optimale Verbindungen effizient Latenz umzukehren erforderlich.
Hier ist ein Protokoll präsentiert, was nutzt einen Hochdurchsatz-Ansatz für funktionale Bewertung der Auswirkungen von Interventionen auf die HIV-LTR-driven Transkription und Spleißen. Kurz gesagt, eine neue LTR-gesteuerte Dual color Reporter System pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Abbildung 1) wird zur Durchflusszytometrie HIV Reaktivierung zu beurteilen. In dieser fluoreszierende Reporter führt die Expression des unspliced mRNA HIV (4 kb), verbesserte grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Ausdruck, während der Begriff der gespleißten mRNA (2 kb) Discosoma SP. rote (DsRed) fluoreszierendes Protein-Expression führen würde. Kurz gesagt, haben wir eine fluoreszierende Env-EGFP Schmelzverfahren Protein, gp140unc verwendet. EGFP, wo die kodierende Sequenz des EGFP in Frame mit einer UN-gespalten und verkürzten Form des Umschlags (Env) platziert wurde. Änderungen wurden eingeführt, um die Spaltstelle verhindern die Dissoziation der Env in gp120 und gp41-EGFP abtragen und zum Abschneiden der gp160-Protein vor der transmembrane Domäne erstellen eine lösliche Env analog, das erleichtert die korrekte Faltung und Ausdruck von EGFP. Auf den Ausdruck innerhalb einer Zelle, Rev lokalisiert in den Zellkern, wo es den nuklearen zytoplasmatischen Export von 4 kb Env vermittelt, mRNA über die Interaktion mit der Rev-responsive Element (RRE). Abschneiden der Env beeinträchtigt nicht die RRE liegt zwischen gp120 und gp41 und der A7 3′ Splice Site. In diesem System Spleißen bei HIV-1 splice Geber 4 (SD4) und Spleiß-Akzeptor 7 (SA7) Ergebnisse bei der Herstellung von 2 kb mRNA Kodierung ein nichtfunktionaler Rev-Protein bei Aminosäure 38 abgeschnitten mit DsRed fluoreszierendes Protein, RevΔ38-DsRed verschmolzen. Kurz gesagt, war das Exon 2Nd von Rev an Aminosäure 38 durch Überlappung Erweiterung18DsRed eingefügt. Um den nuklearen Export von unspliced mRNA zu erleichtern, wurde ein Säugetier Expressionsvektor Codierung Rev (pCMV-RevNL4.3) gemeinsam mit dem fluoreszierenden Reporter Konstrukt (Abbildung 2) transfiziert. Dieses einzigartige Reporter Konstrukt hier beschriebenen eignet sich im Hochdurchsatz-Bewertung der HIV-Übertragung und Spleißen, ohne die Notwendigkeit, virale Vektoren verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Virus-Reaktivierung ex Vivo, infiziert eine Vielzahl von in-vitro-Modelle im Laufe der Zeit entwickelt wurden, um HIV-Latenz einschließlich latent studieren T-Zell-Linien (J-Lats, ACH2, U1), primäre Modelle der latenten Infektion ruhen ( O’ Doherty, Lewin, Greene und Spina-Modelle) oder pre-activated CD4 + T-Zellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn Modelle) mit einzelnen Runde oder Replikation zuständigen Reporter Viren22. Um die physio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Projekt Grant APP1129320 und Programm APP1052979 Stipendium der NHMRC Australia unterstützt. Wir danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson und Michelle Y. Lee für die wesentlichen Konstrukte und Beratung für den erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit. Wir danken auch das DMI-Flow-Anlage Personal für ihre Ratschläge und großzügige Unterstützung bei der Aufrechterhaltung der in dieser Studie verwendeten Durchflusszytometer.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
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