Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage
Summary
Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.
Abstract
Le VIH reste incurable en raison de l’existence d’un réservoir de cellules qui recèle une forme stable et latente du virus, qui reste invisible pour le système immunitaire et n’est pas ciblée par l’antirétroviraux actuels (cART). Transcription et épissage ont démontré que renforcer la latence du VIH-1 au repos des cellules T CD4 +. Inversion de la latence de l’utilisation d’agents de renversement de latence (ALE) dans l’approche de « choc et d’abattage » a été largement étudiée dans le but de purger ce réservoir mais n’a jusqu’à présent pas montré aucun succès dans les essais cliniques en raison du manque de développement des petits adéquate molécules qui peuvent perturber efficacement de ce réservoir. Le protocole présenté ici fournit une méthode pour efficacement et de façon fiable évaluer les agents de renversement de latence (alr) sur la transcription du VIH et l’épissage. Cette approche repose sur l’utilisation d’un journaliste bicolore axée sur le LTR qui permet de mesurer simultanément les effets d’un LRA transcription et épissage par cytométrie en flux. Le protocole décrit ici est suffisant pour les cellules adhérentes, mais aussi les cellules en suspension. Il est utile pour tester un grand nombre de médicaments dans un système à haut débit. La méthode est techniquement simple à mettre en œuvre et économique. En outre, l’utilisation de la cytométrie permet l’évaluation de la viabilité cellulaire et toxicité des médicaments donc en même temps.
Introduction
Malgré un traitement antirétroviral à long terme efficace, le VIH persiste dans un état latent comme un provirus intégré dans la mémoire de cellules T CD4 +1. La structure de la chromatine du VIH-1 5 « promoteur de longue répétition terminale (LTR) et des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et désacétylation par ADN méthyltransférases (DNMT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des mécanismes importants conduisant à la répression transcriptionnelle et donc post-intégration latence2,3. Une grande variété d’agents d’inversion (ALE) de la latence a été étudiée pour leur efficacité induire la production de virus in vitro et in vivo de manière latente infectés au repos T CD4 + cellules4,5,6,7 ,,8. Parmi les LRA testés, HDACi (inhibiteurs d’HDAC) et inhibiteurs de la côté du pari (BETis) induisent la décondensation de la chromatine et la libération de la transcription positive élongation facteur b (P-TEFb) respectivement, conduisant aux soulager de la transcription répression à la 5′ LTR et activation du VIH expression9,10,11,12,13. Toutefois, l’ampleur de la réactivation atteindre par ces collectivités locales et régionales ne se limitait qu’une modeste augmentation associée aux cellules unspliced VIH ARNm (nous RNA), indicatif de transcription virale, a été observée ex vivo14,15. Ce qui est important, ces collectivités locales et régionales a également omis d’induire une diminution de la fréquence des cellules infectées de façon latente.
Expression du VIH peut être encore plus restreint par épissage inefficace16 ainsi que les défauts dans les exportations nucléaires de multiplier épissés ARN VIH (MS RNA)17. Ainsi, l’identification de nouvelles catégories de collectivités locales et régionales qui sont plus puissants et peuvent affecter des aspects distincts de virus production après intégration sont nécessaires. En outre, le développement de nouveaux tests qui aident à définir les composés optimales pour contrer efficacement les temps de latence est nécessaire.
Ici, un protocole est présenté, qui utilise une approche de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de l’impact des interventions axées sur le VIH LTR transcription et épissage. En bref, un nouveau duel axée sur le LTR couleur journaliste système pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figure 1) est utilisé pour évaluer la réactivation du VIH par cytométrie en flux. Dans ce journaliste fluorescent, l’expression de l’ARNm de VIH unspliced (4Ko) conduit à l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), tandis que l’expression de l’ARNm épissé (2KO) conduirait à Acropora SP rouge (DsRed) expression de la protéine fluorescente. En bref, nous avons utilisé une protéine de fusion Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, où la séquence codante de EGFP a été mises en image avec une forme non clivée et tronquée de l’enveloppe (Env). Modifications ont été apportées pour l’ablation du site de clivage empêche la dissociation des Env en gp120 et gp41-EGFP et de tronquer les protéines gp160 avant le domaine transmembranaire créent un analogue Env soluble qui facilite le pliage correct et expression de EGFP. Lors de l’expression dans une cellule, Rev se localise dans le noyau où il intervient dans les exportations nucléaires et cytoplasmiques 4Ko env ARNm via l’interaction avec l’élément sensible de rev (RRE). La troncation d’Env ne compromet pas le RRE, qui se trouve entre le site d’épissage A7 3′ gp120 et gp41. Dans ce système, épissure au VIH-1 donneur 4 (SD4) d’épissure et épisser accepteur 7 (SA7) entraîne la production d’un 2KO ARNm codant pour une protéine Rev non fonctionnels sont tronquée lorsque l’acide aminé 38 fusionnée à la protéine fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. En bref, DsRed a été inséré dans l’exon 2nd de Rev à acides aminés 38 par chevauchement extension18. Afin de faciliter l’exportation nucléaire des ARNm unspliced, un vecteur d’expression mammifère encodage Rev (cmvp-RevNL4.3) a été conjointement transfecté avec la construction de journaliste fluorescent (Figure 2). Cette construction unique journaliste décrite ici est utile dans l’évaluation de haut débit de transcription de VIH et d’épissage, sans la nécessité d’utiliser des vecteurs viraux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compte tenu de la difficulté de mesurer une réactivation du virus ex vivo, un large éventail d’in vitro modèles ont été développés au fil du temps afin d’étudier la latence du VIH, y compris de manière latente infectée lignées de cellules T (J-Lats, ACH2, U1), modèles primaires de l’infection latente de repos) O ‘ Doherty, Lewin, Greene et Spina modèles) ou des cellules T CD4 + pré-activé (Samir, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modèles) avec simple ronde ou réplication journaliste compétente v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet APP1129320 et programme de subvention APP1052979 par le NHMRC australien. Nous remercions le Dr Adam Wheatley, Dr Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson et Michelle Y. Lee pour fournir les concepts essentiels et des conseils pour la réussite de ce travail. Nous remercions également le personnel de DMI Flow Facility pour leurs conseils et leur aide généreuse à maintenir le cytomètre en flux utilisé dans cette étude.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
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