С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки мыши фагоцитоза перитонеальных макрофагов с помощью расширенной зеленого флуоресценции белков выражая Escherichia coli.
Abstract
Эта рукопись описывает простой и воспроизводимый метод для выполнения анализа фагоцитоза. В первой части этого метода предполагает строительство ПЭТ сумо-EGFP вектор (сумо = небольшой убиквитин как модификатор) и выражая зеленый флуоресценции белков (EGFP) в Escherichia coli (BL21DE). Выражая EGFP E. coli coincubated с макрофаги за 1 ч при 37 ° C; отрицательный контроль группы инкубированы на льду за такое же количество времени. Затем макрофаги готовы для оценки. Преимущества этого метода включают шаги его простой и прямой, и фагоцитоза могут быть измерены оба потока цитометр и флуоресцентным микроскопом. Выражая EGFP E. coli являются стабильными и отображать сигнал сильная флуоресценция, даже после того, как макрофаги крепятся с помощью параформальдегида. Этот метод является не только подходит для оценки макрофагов клеточных линий или первичной макрофагов в пробирке, но также подходит для оценки фагоцитоза гранулоцитов и моноцитов в периферической крови мононуклеаров. Результаты показывают, что фагоцитарной способности перитонеальных макрофагов от молодых мышей (8 недельных) выше, чем макрофагов от возраста (16-месячного) мышах. Таким образом этот метод меры макрофагального фагоцитоза и подходит для изучения функции иммунной системы.
Introduction
Макрофагального фагоцитоза анализов часто используются для изучения врожденной иммунной функции. Врожденный иммунный ответ может указывать восприимчивость к инфекции. Линии клетки макрофагального широко используются в исследования иммунологии. Однако расширенный отрывок может привести к потере гена и скомпрометировано иммунной функции в этих клеточных линий. Таким образом основной перитонеальные макрофаги являются идеальный объект для изучения клеток функции1.
Хотя считалось, что врожденный иммунный ответ быть нетронутыми в возрасте тело, фагоцитарной способности может уменьшиться по сравнению с что в младшей тела2,3. Здесь мы покажем способ оценить фагоцитоза перитонеальных макрофагов от молодых (8 недельных) и возраста (16-месячного) мыши, с помощью выражения EGFP E. coli, который удобно, быстро и экономически.
Использование штамма EGFP-выражая E. coli является одним из преимуществ этот assay, потому что эти бактерии являются стабильными и отображать сигнал сильная флуоресценция, даже после того, как макрофаги фиксируются параформальдегида 4% (w/v). Кроме того, с помощью выражения EGFP E. coli, исследователи не требуется дальнейшее окрашивание после фагоцитоза, который экономит время. Кроме того макрофаги являются immunoresponsive для поверхностного антигена E. coli , делая E. coli больше подходит для assay фагоцитоза чем используя EGFP-выражая грибов или помечены флуоресцеин бусины.
С EGFP-выражая E. coliфагоцитоз пробирного можно легко осуществляется в 2 h и измеряется как поток цитометрии и флуоресценции микроскопии, в зависимости от назначения исследователя. Так как этот метод напрямую меры фагоцитарной способности, результаты более воспроизводимые чем другие косвенные методы.
Этот метод также были проверены в линии клетки RAW264.7 и периферической крови человека мононуклеарных клеток4. Приведенный ниже текст содержит подробные пошаговые инструкции для выполнения этот assay и освещаются важнейшие шаги, которые исследователи могут изменять для удовлетворения потребностей своих экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Шаги в этом протоколе, являются довольно простое и понятное. Одним из важных шагов является побудить EGFP выражение на E. coli. Обычно когда ген от эукариот, как EGFP, планируется выразить в прокариотах, таких как кишечная палочка, есть риск, что белка образует неактивные агрегатов (вк?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Национальный фонд Китая естественных наук (№ 31800046) и естественные науки фонд провинции Ляонин (№ 20170540262) поддержали эту работу. Эта работа была выполнена в лаборатории научно-исследовательского центра на второй больницы Даляньский медицинский университет. Авторы хотели бы поблагодарить Сяо-Лин Санг за помощь с проточной цитометрии и Qu Бо и Донг-цюань Ян за их помощь в производстве видео.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
