La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma
Summary
Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.
Abstract
Métodos de inmunohistoquímica (IHC) para el análisis in situ de la expresión de la proteína por microscopia ligera son una poderosa herramienta de investigación y diagnóstico. Sin embargo, la visualización y cuantificación de antígenos múltiples en una sección de tejido solo usando IHC cromogénico convencional es un reto. Proyección de imagen de multiplexado es especialmente relevante en linfoma investigación y diagnóstico, donde los marcadores tienen que interpretarse en el contexto de un microambiente tumoral compleja. Aquí se describe un protocolo para IHC fluorescente multiplexado tinción para posibilitar la evaluación cuantitativa de múltiples objetivos en tipos celulares específicos de interés en el linfoma. El método cubre aspectos de validación de anticuerpo, anticuerpo optimización, la optimización multiplex con marcadores de subtipos de linfoma, la tinción de tejido microarrays (TMA) y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con específicas referencia a linfoma. Usando este método, partituras de la intensidad media de un marcador de interés y el porcentaje de positividad se generan para facilitar aún más el análisis cuantitativo. Multiplexación minimiza la utilización de la muestra y proporciona información espacial para cada marcador de interés.
Introduction
Neoplasias linfoides son causados por la incontrolada proliferación maligna de linfocitos. Estas células son componentes vitales del sistema inmune y localización a los órganos inmunes primarios y secundarios, como la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros sistema linfoide asociado a mucosa. Neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de trastornos que se clasifican basados en una constelación de características, incluyendo la morfología, immunophenotype, características genéticas y la presentación clínica. Mientras que cada parámetro desempeña un papel, sigue siendo una característica que define y constituye la base para el sistema de clasificación de la OMS que reconoce neoplasias derivadas de células B, células T y natural killer (NK) las células1.
Clave para la clasificación del linfoma ha sido la caracterización de los anticuerpos contra marcadores de superficie de leucocitos de los diversos subtipos de linfocitos2. Inmunohistoquímica (IHQ) se ha utilizado tradicionalmente para el análisis de estos marcadores y se basa en el principio del reconocimiento antígeno-anticuerpo específico para detectar moléculas basado en células y tejidos que pueden visualizarse con el microscopio de luz 3. sin embargo, la identificación de objetivos múltiples en una sola diapositiva por IHC multiplex cromogénico convencional de campo brillante tiene limitaciones porque a menudo es difícil distinguir múltiples señales de color en una sección de tejido único fiable — especialmente para los antígenos con una expresión muy baja de4. Evaluación visual y cuantificación de la coloración también pueden ser subjetivas, provocando variabilidad en la interpretación de datos y análisis5.
Por lo tanto, IHC convencional en las muestras (FFPE) formalina-fijos, parafina-encajado no es factible para la detección simultánea de múltiples objetivos en contra diversas enfermedades como el linfoma. Por otra parte, distinguir los linfocitos neoplásticos de las células inmunes circundantes es a menudo imprecisa. Esto impide estudios que la relevancia de nuevos biomarcadores en el linfoma. En este contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) ofrece una alternativa prometedora que permite la evaluación cuantitativa de coexpression de antígeno y una relación espacial con mayor precisión mientras que la conservación limitada de las muestras6,7. Cuando esta tecnología está asociada con el software de análisis digital de imágenes, la interpretación de los datos es más eficiente y facilita el estudio del tumor y microambiente heterogeneidad8,9. En el presente Protocolo, una base de tyramide inmunofluorescencia (IF) método de multiplexación se aplica para amplificar la señal y es compatible con cualquier anticuerpo IHC-validado de cualquier especie, incluso los desarrollados en la misma especie5,7 , 10. el protocolo de tyramide permite la conjugación directa del fluoróforo al tejido de interés para que el anticuerpo primario y secundario puede ser despojado después de cada paso, permitiendo la aplicación secuencial de múltiples manchas sin reactividad cruzada del anticuerpo.
Una estrategia de multiplexado será útil para predecir el pronóstico y el tratamiento de los resultados mediante la identificación de objetivos y sus variante patrones inmunológicos en linfomas. MULTIPLEX fluorescente IHC se ha aplicado en nuestro laboratorio para el estudio de un panel de marcadores T y linfocitos B y T-folicular ayudante en linfoma angioimmunoblastic T-cell (AITL), un subtipo de linfoma T-cell periférico caracterizado por agresivas clínica comportamiento y tumor heterogeneidad11. La utilidad de este método se ilustra también en linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) donde la mayor señalización de un receptor de células B con expresión simultánea de C-MYC y BCL-2 sugiere el posible uso terapéutico de la inhibición de la cinasa de tirosina de Bruton 12 .
Aquí describimos el conjunto del Protocolo de validación del anticuerpo a la selección de tejidos de control apropiado y multiplexación usando linfoma FFPE tejidos, con un eventual análisis de diapositivas manchadas, utilizando un análisis automatizado de imágenes de patología cuantitativa sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC tiene el potencial para permitir que los patólogos perfeccionando diagnosticcriteria en patología linfoide y analizar el papel de los biomarcadores en tipos específicos de la célula hacia una predicción del resultado clínico. Como un nuevo método de investigación, mf-IHC se aplica cada vez más a la identificación cuantitativa y espacial de múltiples parámetros inmunes de las células de tumor17. La detección de mf-IHC de la coexpresión de marcadores biológicos de tumor ha dem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. y A.D.J. son apoyados por el médicos investigación Consejo transición premios de Ministerio de salud Singapur nacionales (NMRC/TA/0020/2013 y NMRC/TA/0052/2016). Los autores reconocen una beca de investigación Yoon Yong Siew a A.D.J. de la Universidad Nacional cáncer Institute de Singapur hacia la compra de un microscopio de proyección de imagen espectral de Vectra. Este estudio es aprobado por el Singapur NHG dominio específico de Junta B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
