Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Lymphoide Neubildungen entstehen durch das unkontrollierte maligne Proliferation von Lymphozyten. Diese Zellen sind wichtige Komponenten des Immunsystems und die primäre und sekundäre immun Organe wie Knochenmark, Lymphknoten, Milz und anderen Mukosa-assoziierten lymphatischen System zu lokalisieren. Lymphatischen Tumoren bilden eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die eingestuft werden, basierend auf einer Konstellation von Features, einschließlich Morphologie, Immunophenotype, genetischen Eigenschaften und klinische Präsentation. Während jeder Parameter eine Rolle spielt, bleibt ein bezeichnendes Merkmal Abstammung und bildet die Grundlage für das Klassifikationssystem der WHO, das Neubildungen abgeleitet von B-Zellen, T-Zellen und natürlichen killer (NK) Zellen¹erkennt.

Entscheidend für die Einstufung des Lymphoms ist die Charakterisierung von Antikörpern gegen Leukozyten Oberflächenmarker der verschiedenen Untertypen von Lymphozyten²gewesen. Immunhistochemie (IHC) ist traditionell für die Analyse solcher Marker benutzt worden und basiert auf dem Prinzip der spezifischen Antigen-Antikörper-Anerkennung, Zell- und gewebebasierten Moleküle erkennen, die durch das Lichtmikroskop ^{visualisiert werden können 3}. die Identifizierung von mehreren Zielen auf eine einzelne Folie durch konventionelle Hellfeld chromogene multiplex IHC hat jedoch Einschränkungen, da es oft schwierig, mehrere Farbsignale auf einem einzigen Gewebe zuverlässig zu unterscheiden ist – vor allem für Antigene mit sehr geringe Expression⁴. Visuelle Beurteilung und Quantifizierung der Färbung auch kann subjektiv, Variabilität in der Analyse und Interpretation⁵verursachen.

Deshalb ist herkömmlichen IHC auf Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben nicht möglich für die simultane Detektion von mehreren Zielen bei immunologisch unterschiedlichen Erkrankungen wie Lymphom. Darüber hinaus ist die Unterscheidung neoplastischer Lymphozyten aus den umliegenden Immunzellen oft ungenau. Dies behindert den Studien über die Relevanz der neue Biomarker Lymphom. In diesem Zusammenhang multiplex fluoreszierende IHC (mf-IHC) bietet eine viel versprechende Alternative, da die quantitative Bewertung von Antigen Coexpression und eine räumliche Beziehung mit höherer Präzision bei gleichzeitiger Einsparung von begrenzt^6,Proben^7. Wenn diese imaging-Technologie eine mit der digitalen Bildanalyse-Software Partnerschaft ist, die Interpretation der Daten ist effizienter gestaltet und erleichtert das Studium der Tumor und Mikroumgebung Heterogenität^8,9. In diesem Protokoll eine Tyramide-basierte Immunfluoreszenz (IF) multiplexing-Verfahren wird angewendet, um das Signal zu verstärken und ist kompatibel mit jedem IHC validiert Antikörper aus jedem Wirtsarten, auch diejenigen entwickelt, die in der gleichen Spezies^{5,7 , 10}. Tyramide-basiertes Protokoll ermöglicht die direkte Konjugation der Fluorophor des Gewebes von Interesse, dass die primäre und sekundäre Antikörper nach jedem Schritt, die sequenzielle Anwendung mehrere Flecken entfernt werden kann ohne Antikörper Kreuzreaktivität.

Eine gebündelte Strategie wird für die Vorhersage Prognose und Behandlung Ergebnisse durch die Identifizierung von Zielen und deren Variante immunologischen Muster in Lymphome nützlich sein. Multiplex-Leuchtstofflampen IHC angewendet wurde in unserem Labor für die Studie eines Panels von T- und B-Lymphozyten und T-follikulären Helfer Marker Angioimmunoblastic T-Zell-Lymphom (AITL), ein Subtyp des eine periphere T-Zell-Lymphom zeichnet sich durch aggressive klinische Verhalten und Tumor Heterogenität¹¹. Der Nutzen dieser Methode zeigt auch diffuse große B-Zell-Lymphom (DLBCL) wo die erhöhte Signalisierung eines B-Zell-Rezeptors mit gleichzeitiger C-MYC und BCL-2 Ausdruck den möglichen therapeutischen Einsatz von Brutons Tyrosin-Kinase Hemmung schlägt ¹² .

Hier beschreiben wir das gesamte Protokoll von Antikörper-Validierung, die Auswahl der angemessenen Kontrolle Gewebe und Multiplexen mit Lymphom FFPE Gewebe, mit einer späteren Analyse der gefärbten Folien mit einer Scan-automatisierte quantitative Pathologie Bildgebung System.