両生類における卵巣モニタリングと制御のための生殖技術

形態測定と生殖 両生類における女性の生殖状態の可視化は、種によって異なる。最も効果的な方法は、超音波です。しかし、一部の種は、皮膚の透明度の変化を示す場合があります(図13A,B,C)。目視検査は、N.アラバメンシスとN.黄斑症で観察される皮膚が半半透明である場合、重力と非重力の女性の違いを明確に示すことができる(図13A,B);。またはガラスカエルによって示されるように半透明(図13C)。N.ベエリの腹部の暗い斑点皮膚の着色は、この評価が行われることを禁止します。R.muscosaでは、皮膚は半透明ではありませんが、皮膚が剥離しているため、最近卵巣に溶解したメスと比較して顕著な違いが検出され、動物は薄く見えます(黄色い線)グラビッド(青い線)の女性(図13D)。経験を持つハンドラーは、大きな女性と重力の1の違いに慣れることができますが、重力段階の確認は超音波を必要とします。両生類の体重指数は、多くの数式を使用して計算できますが、生殖のための予測ツールとしての応用は議論の余地があります。R.ムスコサの場合、フルトンの指数、健康および生殖状態との相関関係は不明のままである。 生殖行動と超音波 我々の結果は、卵巣の予測のためにR.ムスコサにおける生殖行動を特徴付ける方法を示す(図4)。数時間から数週間に及ぶいくつかの段階には、男性が積極的に女性を追いかける求愛(図4A)、オスが女性の背中にしっかりと留め、十分な数と呼ばれる(図4B)。一度十分に切断されると、ペアは1-5週間十分に残ることができ、ペアは、十分に加えて、他の動作を表示します。Amplexusは、男性が柔らかいポンピング方法で女性を圧迫することを含む非常に活発な行動です(図4C);。女性が動き回り、断続的にハンドスタンドの動作を表示し始める(図4D,E);そして、卵の時間に近い、女性は、手立てで、男性が彼女の腹部を激しくポンプしながら、彼女が卵を貼ることができる表面に傾きます(この場合、女性が下から下方に彼女の腹部をこするのを観察することも可能です)彼女の腕はクローカに向かってピット。これは卵管に卵を押し下げる機械的な方法かもしれません)(図4F、G)。 本研究は、超音波が女性R.ムスコサおよびネクトゥルスの生殖状態を確認するための情報を提供する方法を示す。R.ムスコサ(図5C、D、E、F)で4段階の開発段階が表され、同様にネクチュラス4(図6A、B、C)で特徴付けられています。また、残留卵は卵の保持につながる追放に失敗する可能性があります(図5G、図15A、B)。ステージ1は、卵胞が視覚化しにくい卵巣の直後の卵巣を示す(図5C)。ステージ2は、卵巣全体に分散したエコードット(白い斑点)の出現によって表される(図5D)。ステージ2および3は、大きな中~大きな卵胞を表す暗い中心を持つ、より大きな丸みを帯びたエコー元ドットで表されます(図5E,F)。2013年から2017年まで、捕虜の女性ネクトゥルスは毎月超音波検査で検査を受けた。各試験の間、個人は属のために確立された生殖基準に従って成績のスコアを割り当てられました(表2)。毎年新しい卵を発達する雌の割合は平均88.2±3.01%であった(表5)。卵の発生が高い一方で、卵巣は確保されなかった(図16)。卵化を受けた雌の大半は卵の完全な補体を堆積させ、一部の個体は発達した卵のほんの一部しか堆積しなかった。体腔内の体液ゲインと一致する保持卵を持つそれらのR.ムスコサおよびネクチュラスメスは、破裂した血管と一致する皮膚上の赤い斑点と外側に視覚的に拡大した(図14A,B)) .体液貯留の程度は、超音波(図15B)を介してさらに評価することができる。いずれの種でも、保持卵は切断症を受けたり、よりエコー原性の外観を受けたりした(図14C,D,図15A)。 ホルモン投与 注射のタイプの深さに応じて、針の角度と深さが異なります。ほとんどの注射では、R.muscosaなどの種で作業する場合、針の深さは1-2ミリメートル以上である必要はありませんが、浸透の角度が異なります。プロスタグランジン注射は、90°で角度付きの内筋(im)針挿入を必要とし、R.ムスコサの後脚に、内腔内(ip)注射は、筋肉内注射と同様の深さで、の領域で投与された。45°でのコエロミックキャビティ(図10)。アンフィプレックスの投与は、コントロール(P=0.547)と比較してホルモン処理された雌によって沈着する卵の数を増やすことに有意な効果を持たず(P= 0.673)、またはオタマジャクシに生き残った胚の数に違いはなかった(P=0.629) (表4)一般的に、女性のオビポジスの割合は、2011年の80%から2014年には28%に減少した。2015年の女性のオビポシティングの数は、2013年(P= 0.0002)、2013年(P=0.0001)、2014年(P=0.0026)よりも有意に高かったが、2011年(P= 0.0885)ではなく、この種の女性が毎年の繁殖を必要としないという考えを再確認した。ネメント。卵の保持の徴候を持つR.ムスコサ女性の場合、PGF2αの筋肉内注射は、退化卵の追放を誘発する60%の成功率を持っていた。しかし、注射された5匹の雌のうちの1匹では、PGF2αは完全な追放を引き起こすのに十分ではなく、一部の卵は次の繁殖期まで雌の中に残った。17人のネクトゥルス女性がLHRH/(GnRH)を受け取り、13人がコントロールとして機能する滅菌水の偽注入を受けた(表5)。合計で、7人の雌ネクトゥルス(n=4アラバメンシス、n=2ベエリ、n=1黄斑)は、GnRH処理(n=6)および対照(n=5)個体の両方に起因する11個のフルクラッチに続いた。3匹の雌(n=2ベエリ、n=1黄斑)は5つの部分クラッチをオビポサイト化した(図13)。この現象は、3人の対照女性が同様に部分クラッチを堆積させたため、外因性ホルモン治療と関連しているようには見えなかった(表5)。オビポジションは、5年間にわたり37日間(3/31-5/7)の期間にわたって発生しました(表5)。LHRH/GnRH処理済みの卵子化率に差はなかった(P = 0.194)(41± 13.08%、範囲17-67%)および制御 (66.75 ± 11.79%、範囲 50-100%)女性。LHRH/GnRH処理されたメスは、注射後の平均7.44±1.41(範囲3-13)の卵を堆積させた。種の完全に水生性の性質と麻酔なしで手動で拘束することができないことを考えると、IPホルモン注射を行う前に適切なレベルの鎮圧を確保する必要がありました(麻酔の指示についてはセクション3.2を参照)。 採血、麻酔、手術 この記事の血液採取技術はForzan et al. 201310から採取され、侵襲性とストレスを最小限に抑えてR.ムスコサから血液を採取する効果的な方法を証明した。マイクロヘマトクリットチューブを用い、全血70μL当たり約35~45μlの血漿または血清を採取することができる(図7)。R.muscosaの最大回収量は、カエル10g当たり1個の完全なマイクロヘマトクリットチューブで、カエル1匹につき4個のチューブを40g以上でした。これは、100g当たり0.7mLの保存的な回収量であり、100g当たり1.0mLの最大推奨値の70%(アレンダーとフライ、2008年から適応)13であった。 両生類の麻酔や手術はめったに報告されませんが、用量と有効性は種固有の方法で異なることを注意することが重要です。例えばボンビナオリエンタリスでは、MS222は高用量(1g/L)でも非常に低い効果を有し、ボリアルヒキガエルではアナキシラスボレアス、1g/Lは速く(分の問題)と長続きする(3+h)(カラタユド、個人的な観察)。R.ムスコサでは、麻酔はA.ボレアスのために報告された用量を必要とし、同様の効果と回復時間を有する。麻酔前の断食両生類は、全身麻酔下でも喉頭がしっかりと閉じたままで、通常は必要ありません。しかし、必要と認められる場合、特に麻酔手術がセロミック手術を含む場合、動物は麻酔前に24時間断食することができる。 手術中、右反射は動物が麻酔化されたことを主な指標としています。右反射は、動物が背中に置かれた後に直立した位置に戻ることができる能力と容易さの程度です。反射の喪失は麻酔の軽い段階を示唆する。外科面は、それをまっすぐにするために四肢を軽く引っ張ることを含む撤退反射の損失によって示され、動物はもはやそれを引き込むことのできない7.生殖手術には圧倒的な障害はなく、両生類の患者は主に高い脊椎動物よりも多くの失血を許容して治癒する。手術は、最初から最後まで約15分間続く、迅速に進行する必要があります。ステップは、最初の切開のための<1分、セリオトミーおよびリトラクタ挿入の場合は<2分、卵巣あたりの単離のための<2分、血管縫合またはテーター化および皮膚縫合<4分の間に<1分の時間を計る必要があります。MS222プロトコルによる手術後の総回復時間は約45分ですが、これは種固有の場合があります。A. ボアスボレアスとR.ムスコサの回復時間は、1 – 2時間まで長くなる可能性があります。手術を行う場合は、肺、消化管、または膀胱の穿刺を避け、大腸腺、リンパ心臓、血管、特に中腹部静脈に損傷を与えないように注意する必要があります。季節に応じて、大きな脂肪体の存在は、他の臓器の視覚化を困難にすることができます。目に見えて目が覚めると、後肢の緩やかな伸びに対する抵抗や、眼の周りの領域が刺激されたときに点滅する(個人的な観察)など、四肢刺激に対する動物の反応は、離脱反応として分類される。右反射は、撤退反射と神経の動きを含む他の回復指標と一緒に、回復の重要な指標です。 管理 共通名 種 ホルモン 手順 プライミングコンパウンド 報告されたプライミング用量 プライミング用量の数 タイミング (排卵用量の前の時間) 最終的な排卵/卵巣のために投与される化合物 用量 参照 プエルトリコのヒキガエル ペルトフリンキツネザル GnRHとhCG Ip Hcg 1.5 IU/g 2 hCG – 48 GnRH;hCG;GnRHa + hCG 0.2 μg;4 IU;0.5 μg + 4 IU カラタユドら未発表 山の黄色い足のカエル ラナ・ムスコサ アンフィプレックス, ルト Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, プロ-NHEt9-GnRH) 0.4 μg/g 1 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g カラタユドら, 2018 PGF2α Im PGF2α 5 ng/g 1 48歳 PGF2α 5 ng/g 南ロッキーマウンテンボリアルヒキガエル アナキシラス・ボレアス hCG, GnRH Ip Hcg 3.7 IU/g 2 96、24 hCG + GnRHa 13.5 IU/g + 0.4 μg/g カラタユドら, 2015 ノーザンクリケットカエル アクリス・クレピタン アンフィプレックス 水に加え (10 mL) なし なし 0 Na GnRH + メット 0.17 μg + 0.42 μg / μl スナイダーら, 2012 北ヒョウカエル リトバテス・ピピエンス アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g トルドーら, 2010 アルゼンチンの角カエル セラトフィルオルナタ アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g クランウェルの角のカエル セラトフリース・クランウェリ アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g アメリカの地上カエル オドントフリヌス・アメリカンヌス アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g ダスキーゴーファーカエル ラナ・セヴォーサ hCG, GnRH Ip Hcg 3.7 IU/g 2 96、24 GnRH + hCG 1 x 0.4 μg/g + 13.5 IU/g グラハムら, 2018 コキ エリューセロダクチルス・コキ 魚、鳥類、哺乳類、GnRH(D-アラ、デグリー、エスLHRH)、hCG Sc mLHRH; アラー;fLHRH;GnRHa;Hcg なし 0 Na mLHRH; アラー;fLHRH;GnRHa;Hcg 7μg、 33μg;28μg;7μg、 20μg;5, 10, 15, 20 μg;165 IU マイケルら 2004 ガンターのヒキガエル シュードフリン・グエンテリ Gnrh グンラ 0.4 μg/g 1 26歳 GnRHa の有無にかかわらず 0.4 μg/g 新羅 2010 コロボリーカエル シュードフリン・コロボリー ルクレリン Sc ルクレリン 1 μg 1 26歳 ルクレリン 5 μg バーン&新羅、2010 北コロボリーカエル シュードフリン・ペンギレイ GnRHa GnRH (D-アラ、 デスグリー、 eth LHRH) Ta なし なし 0 Na グンラ 0.5 -2.0 μg/g 新羅ら, 2017 湾岸ウォータードッグ ネクトゥルス・ベエリ [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RHエチルアミド酢酸塩水和物 Ip なし なし 0 Na LHRH 100 μg / 500 μL Stoops et al., 2014 南ベルカエル /うなり草カエル リトリア・ラニフォルム des-Gly10, D- アラ6-[LHRH] Sc なし なし 0 Na des-Gly10, D- アラ6-[LHRH] 50 μg Mann et al., 2010 ファウラーのヒキガエル アナキシルス・ファウレリ GnRH、hCG、P4 Ip Hcg 3.7 IU/g ブラウンら,2006 アクソロトル (メキシコのサラマンダー) アンビストマ・メキシナム 卵胞刺激ホルモン Im なし なし 0 Na Fsh 400IU トロティエとアームストロング(1974年) アフリカの爪のカエル ゼノプス・ラエビス hCG および P4 水を加えた。Ip PMSG、hCG マルセック 、 2016 タイガーサラマンダー アンビストマ・ティグリナム hCG, LH ワイオミングヒキガエル アナクシラス・バクスターリ hCG, GnRHa, P4 Ip hCG + GnRHa 100 IU + 0.8 μg 1 72歳 hCG + GnRHa 100 IU + 0.8 μg ブラウンら,2006 北ヒョウカエル リトバテス・ピピエンス 下垂体エキス(PE)、P4、テストステロン(T)、コルチコステロン[C]、アンフィプレックス、ドンペリドン(D) SC、IP なし なし 0 Na PE, PE+T, PE+P4, PE+C;アンフィプレックス、 GnRH + D 1 mL で約 100 IU (LHRH) ;PE+0.002μg/μL;PE+0.01mg/50mL;PE+0.1mg/50mL;0.4 μg/g + 10 μg/g; 0.4 μg/g + D ライト、1961年。フォート、2000年;トルドーら, 2013 地上カエル リンパ時代のタスメニエンシス 下垂体抽出物, hCG, GnRHa, PZ Ip グンラ 0.9-1.2μg/g + PZ 10 μg/g 1 20歳 PE;PE + hCG;GnRH + PZ PE ボル;PE vol + 100 IU hCG;GnRH (0.9-1.2μg/g) + PZ (10μg/g) クルーローら, 2018 緑と黄金の鐘のカエル リトアイア・アウレア Gnrh Ip グンラ 10 μg 1 72歳 GnRHa + hCG 20 μg + 300 IU クルーローら, 2018 グレートバールカエル ミクソフェイズ・ファシオラトゥス hCG および PMSG Sc PMSG、hCG 50 IU & 25 IU;1×100 IU 2;2 PMSG-144 & 96; hCG-24 Hcg 100IU クルーローら, 2012 より多くのホルモンプロトコルと種については、ライトとウィテカーを参照してください, 2001 表1:両生類種および外因性ホルモンの一部は、文献で報告されているようにそれらに試験した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG);ゴナドトロピン放出ホルモン (GnRH);放電ホルモン放出ホルモン (LHRH);文字m、aおよびfは「哺乳類」、’鳥類’および’魚’を表します。妊娠中のマレ血清ゴナドトロピン (PMSG);プロゲステロン (P4);卵胞刺激ホルモン FSH);下垂体抽出物 (PE);テストステロン (T);コルチコステロン(C)。記載されているドーパミンアンタゴニストが含まれます: ドンペリドン (D);ピモジド (P);メトクロプラミド(MET)。アンフィプレックスは、GnRHおよびメトクロプラミド27から成る化合物に与えられる名前である。ルクリンは、有効成分が酢酸レプ酸レポロリンである市販のGnRHアゴニストです。4,7,17歳,18歳,19歳,20歳,26歳,27歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42歳,43歳,44歳,45歳 グレード 生殖状態 説明 0 非グラビッド 卵は見えない 1 早期グラビッド 目に見える卵(1〜2ミリメートルの大きさ)は、卵に関連付けられている明確なエコーラインはありません。 2 ミッドグラビッド 卵2〜3ミリメートルの大きさ、各卵に関連付けられている明確なエコーライン。 3 後期グラビッド 卵4〜5mmの大きさ、エコー原性線はまだ目に見える、卵の無響外観の顕著な増加。 4 保持卵 内部卵構造に存在するエコー元物質の様々な程度は、非晶質形状を取る。いくつかは非常にエコーゲンになり、体腔内の体液貯留に関連付けられて. 表2:捕虜女性ネクトゥルスの生殖状態をスコアリングするために使用されるグレーディングシステムとラナ・ムスコサ超音波検査によって。 薬物 投与量とルート コメント – リファレンス ブプレノルフィン 50 mg/Kg (イントラスロミック) 東部赤色斑ニュート(ノトフタルムスビリセンス)での実験的研究。鎮鎮薬は手術前に行われるべきである。(コーラー、2009) ブトルファノール 1 – 10 mg/Kg (IM またはイントラスロミック) 様々な特定の責任があります。1 mg/kg から始することをお勧めします。 ブトルファノール 0.5 mg/L (お風呂) 東部赤色斑ニュート(ノトフタルムスビリセンス)での実験的研究。(コーラー、2009) フェンタニル 1 mg/kg 鎮食器> 4時間, ナルトレキソンによって拮抗 (スティーブンス, 1997) メロキシカム 0.1 ~ 0.2 mg/kg (IM) (2011年ミンター) 表3:両生類の鎮鎮薬のためのプロトコル。 ラナ・ムスコサ 年 2014年 2015年 いいえ ♀ 18歳 18歳 卵の発達 61パーセント 94パーセント 制御♀ 4 6 アンフィプレックス♀ 4 7 平均日ポストアンフィプレックスからオビポジットへ 10.5年 10.9年 オビポジションレート(アンフィプレックス) 22.20パーセント 33.33パーセント オビポジションレート(コントロール) 22.20パーセント 38.88パーセント 表4:コントロール捕虜雌と比較した両比レックス処理間の生殖パラメータの比較ラナ・ムスコサ2014年と2015年に。 ネクトゥルスsp. 年 1 2 3 4 5 いいえ ♀ 6* 7 7* 7* 7* 卵の発達 83パーセント 100パーセント 86パーセント 86パーセント 86パーセント LHRH ♀ 3 5 3 6 0 制御♀ 2 2 3 0 6 ポストLHRHからオビポシットへ 5 7 5.5 (範囲 3 ~ 8) 13歳 N/a オビポジションレート(LHRH) 60パーセント 20パーセント 67パーセント 17パーセント N/a オビポジションレート(コントロール) 50パーセント 50パーセント 100パーセント N/a 67パーセント * n=1 ♀卵の発達なし 表5:LHRH間の生殖パラメータの比較(GnRH)-治療と制御(滅菌水)キャプティブ女性ネクトゥルス5年間の3種から(2012-2017) 図1:カエルを保持する3つの方法。(A) 手順 1.(B) 手順 2.(C) 手順 3.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: 形態学的評価。(A, B)SVL/SUL (C, D)体重,R.ムスコサとD.ネクトゥルスで(E) キャリパーによるサイズ測定。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:性的な変形は、女性と比較して成人R.ムスコサ男性の鼻親指パッドによって区別される。(A)女性(B)男性.下のパネルは、男性対女性の長さを示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:R.ムスコサにおける卵巣に至る生殖行動の特徴付け(A) 求人。(B) アンプレクサス。(C) オスは、十分な数の中で女性を絞る。(D, E)手立ちの女性。(F, G)腹部の収縮と卵巣。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:発達段階4に従って生殖状態を持つR.ムスコサA-Bに対して行われた超音波。(A,B)ラナ・ムスコサで超音波検査を行う。(C) グレード 0.(D) グレード1。(E) グレード2。(F) グレード3。(G) グレード4(排卵・保存卵)こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。 図6:ネクトゥルスの超音波画像。(A) グレード1。(B) グレード2。(C)グレード3の卵。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図7:R.ムスコサにおける血液採取。(A) 静脈軌道後部を、軌道の真ん中にある顎線のすぐ上の顔面静脈に穿刺して採取する。(B, C)血液は皮膚の表面に放出され、ヘパリン化された毛細管で採取される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図8:両生類における注射方法。注射のタイプの深さに応じて、針の角度と深さが異なります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図9:R.ムスコサにおけるホルモン注射。ラナ・ムスコサ女性におけるホルモン治療による卵巣の誘導は、両膜内に注入した。卵巣は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図10:手術前の準備。(A)希釈ポビドネヨウ素溶液(1/10)を用いて手術領域の無菌調製物(1/10)、トラキセファルス樹脂。(B)キセノプス・レービスまたは(C)レーザー・ダイオード皮膚切開におけるきれいなメス切開、リトバテス・カテスベアヌス。(D) 中腹部静脈、トラキセファルス樹脂を損傷しないようにする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図11:キセノプス・レービスにおける眼腫瘍(A) 大きな脂肪体を露出して動かして卵塊を明らかにする。(B) 血管をライゲーションすることなく卵塊の一部を切除する。(C) 完全な血管を完全に腫瘍腫取りのために、電気焼灼によって周囲の血管を焼く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図12:A.メキシコにおける前外科的製剤および腫瘍手術(A)滅菌ガーゼに浸漬し、0.75%クロルヘキシジン溶液を手術部位に塗布(B)。肩と後肢の間の線は、動物を3つの等しい部分に分割し、青いスポットは切開部の部位をマークします。(C) まぶたリトラクタでコエロミクス切開を撤回する。(D) 完全な耳たぶ目の場合は、電気焼灼によって周囲の血管を焼き上ける。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図13:生殖段階の視覚的評価(A, B)半半透明の皮膚、ネクトゥルスを介した生殖段階の視覚評価。(C) 半透明の皮膚、ヒアリノバトラキウム(ガラスカエル)。(D) 前(右、青い線)と卵巣後(左 – 黄色の線)の前にR.ムスコサの視覚的評価。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図14:卵の保持。(A, B)卵保持の重症例を有するメスラナ・ムスコサ。(C)超音波は、古い退化、卵(上)と大きな卵(中央および下部パネル)排卵し、コエロムに閉じ込められている示しています。(D) 手動ストリッピングによって取り出された保持卵。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図15:(A)が外観(円)でエコー原性となり、体腔内の(B)体液貯留(矢印)に関連したネクチュラスにおける保持卵の超音波画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図16:完全または部分的なクラッチ(2013-2017)をオビポサイト化した捕虜女性ネクトゥルスの割合(2013-2017)は、オビポシットをしなかったものと比較した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。