نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى
Summary
يصف هذا المقال طريقة جديدة لتوليد مستضد الورم محددة المستحثة المتعددة القوى الخلايا الجذعية المستمدة من المهاجرين الثيميك (iTE) من قبل نظام الثقافة الثهيميك ثلاثي الأبعاد (3D). iTE هي مجموعة فرعية متجانسة من الخلايا T ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا T السذاجة مع القدرة على الانتشار، وتشكيل الذاكرة، وقمع الورم.
Abstract
إن وراثة مستقبلات الخلايا T التي تم إعادة ترتيبها مسبقًا (TCRs) وتجديدها الجيني يجعل الخلايا الجذعية المتعددة القوى المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC) مصدراً واعداً للعلاج بالخلايا T بالتبني (ACT). ومع ذلك، فإن الأساليب الكلاسيكية في المختبر لإنتاج الخلايا T المجددة من iPSC تؤدي إما إلى الخلايا T الفطرية أو المتمايزة بشكل نهائي، والتي تتميز بشكل ظاهري ووظيفي عن الخلايا الساذجة T. في الآونة الأخيرة، تم تطوير رواية ثلاثية الأبعاد (3D) نظام الثقافة الثيميك لتوليد مجموعة فرعية متجانسة من CD8αβ+ الخلايا T مستضد محددة مع النمط الظاهري الوظيفي T الخلية السذاجة، بما في ذلك القدرة على الانتشار، وتشكيل الذاكرة ، وقمع الورم في الجسم الحي. يتفادى هذا البروتوكول مصائر النمو الشاذة، مما يسمح بتوليد خلايا T مشتقة من iPSC ذات الصلة سريرياً، والمصنفة كمهاجرين ثيميك مشتقة من iPSC(iTE)، مع توفير أداة قوية لتوضيح الوظائف اللاحقة الضرورية لنضج الخلية T بعد اختيار الغدة الصعترية.
Introduction
يمكن أن يكون العلاج بالخلايا T بالتبني (ACT) علاجًا فعالًا لبعض المرضى المصابين بالسرطان المتقدم. لسوء الحظ، العديد من المرضى لا يعانون من تراجع الورم، والخلايا المنقولة تفشل في الاستمرار بعد التسريب. قد يكون هذا بسبب جودة الخلايا T غرست. وأظهر نموذج الماوس ACT أنه بالمقارنة مع الخلايا T الذاكرة المركزية السذاجة أو أقل تميزا، والخلايا تأثير متباينة بشكل نهائي هي أقل قوة بسبب الفقراء في استمرار الجسم الحي1، وهي ملاحظة تدعمها أيضا البيانات السريرية2، 3.
في محاولة لتحسين فعالية ACT الحالي، وقد درست الخلايا الجذعية المضادة للقوى المستحثة T (T-iPSC) على نطاق واسع4،5. عندما يتم إعادة برمجة الخلايا T في T-iPSC وإعادة تمييزها في الخلايا T، يتم وراثة التكوين المعاد ترتيبها من جينات TCR بواسطة T-iPSC، وبالتالي الخلايا T المعاد تمييزها. ولذلك، فإن قدرة T-iPSC على الخضوع للتوسع غير محدود في المختبر يسمح بالتكاثر الفعال للخلايا T غير الناضجة التي تحمل مستقبلات الخلايا T الخاصة بمستضد جديد (TCR) عندما يتم تصميم هذه الخلايا من الخلايا T مستضد الورم6 ،7. ومع ذلك، فإن الطريقة الدقيقة للتمييز بين T-iPSC في الخلايا T الناضجة، والتي من شأنها أن تسمح بإنتاج الخلايا T مستضد السرطان محددة مع النمط الظاهري أقل تميزا وأفضل فعالية المضادة للورم، لا يزال يتعين توضيحها.
T-iPSC التمايز توظيف الثقافة المشتركة للخلايا سترومال murine OP9 الإفراط في التعبير عن الإنسان الشق ligand DLL1 هو أسلوب راسخ لإنتاج الخلايا T في المختبر6،7. في الفئران والبشر، وهذا النظام الثقافة المشتركة يمكن أن تميز باستمرار iPSC، وبالتالي تلخيص الأحداث التنموية من مرحلة الكيسة الكيسية حتى غير ناضجة T خلية النسب المرحلة6،7. وعلى الرغم من هذه التطورات التكنولوجية الحيوية، لا يزال من الصعب تحقيق التمايز الفسيولوجي بعد مرحلة CD4+CD8+ الإيجابية المزدوجة (DP). أحد الأسباب هو أنه في الجسم الحي CD4+CD8– CD4–CD8+ خلايا T إيجابية واحدة (SP) يتم إنشاؤها في الغدة الصعترية، وهو جهاز مسؤول عن نضج واختيار الخلايا T التي لديها مستضد أجنبي ولكن لا النشاط التلقائي8. وتُعرَّف هذه العمليات الانتقائية بأنها اختيار إيجابي وسلبي، على التوالي. ومع ذلك، فإن معظم الآليات الجزيئية اللازمة لنضج الخلايا T في الغدة الصعترية لا تزال غير مفهومة تماما، مما يجعل من الصعب إعادة بناء هذه العملية في المختبر. في محاولة للتغلب على هذه العقبة الفسيولوجية، وقد حفزت عدة مجموعات مجمع TCR باستخدام الأجسام المضادة CD3 أو الببتيدات المؤثرة. هذه التقنيات في المختبر توليد منتجات الخلايا التي تعبر عن علامات الخلية T الرئيسية، مثل CD3، CD8αβ، TCRαβ، وCD62L، مع الحفاظ على خصوصية مستضد الورم. لسوء الحظ، تشكل الخلايا T الناتجة عن هذه الأساليب خارج الثيميك مجموعة واسعة من الخلايا غير المتجانسة تتميز بانتقاء إيجابي غير كامل، وميزات تشبه الفطرية، والقتل غير محدد TCR، وعدم القدرة على تكوين الذاكرة، و الآثار المضادة للورم غير المستمرة في الجسم الحي8،9،10،11. وقد أثارت هذه التشوهات مخاوف من أن مثل هذه الخلايا قد تؤدي إلى مجموعة متنوعة من الآثار الجانبية، بما في ذلك سرطان الغدد الليمفاوية وتشوهات الجلد والعظام على حد سواء، إذا ما استخدمت للتطبيقات العلاجية12،13،14 .
لإعادة إنشاء الإشارات الفسيولوجية المفقودة في أنظمة التمايز الحالية في المختبر، تم تمييز T-iPSC مستضد الورم محددة باستخدام الغدة الصعترية حصادها. تم تحسين نظام ثقافة الجهاز الغدي الصعتري الجنيني الكلاسيكي (FTOC)، الذي تم تصميمه لدراسة التطور داخل خلايا T، باستخدام نظام ثقافة ثلاثي الدّي الذي نجح في إنتاج خلايا T التي أكملت تعليم الغدة الصعترية. هذه الخلايا T ما بعد الثهيميك، والتي تم تعيينها على أنها المهاجرين الثيمية المستمدة من iPSC (iTE)، عرضت خصائص تشبه السذاجة15. وأظهرت iTE الانتشار، وتشكيل الذاكرة، والآثار الكافية المضادة للورم في نموذج الماوس ضد أورام الورم الميلانيني B16 المنشأة. توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول هذا النظام FTOC رواية باستخدام نظام ثقافة ثلاثية الجوانب (الشكل1).
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام T-iPSC لتجديد الخلايا T مستضد الورم محددة قد التغلب على العديد من العقبات الحالية من ACT عن طريق توليد الخلايا الشابة مع تحسين الثبات. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن عدة طرق باستخدام نظام الثقافة المشتركة OP9/DLL1 لتوليد خلايا SP CD86و7و10و13 التي تعبر عن جزيئات CD8 وTCRs مستضد الورم، الجينات العالمية تظهر أنماط التعبير والتحليل الوظيفي أن هذه الخلايا CD8 SP المجددة بشكل إضافي تختلف عن الخلايا T السذاجة (الشكل 4). هنا، نقوم بوصف نظام الثقافة الثهيميك ثلاثية الدّيّة الذي يمكن أن يولد المهاجرين الثهيميك المشتقة من iPSC (iTE) مع الإخلاص العالي والتجانس من murine T-iPSC. iTE تشبه الخلايا T السذاجة في نمط التعبير الجيني العالمي وفي الأداء الوظيفي، مثل تكوين الذاكرة وفي الجسم الحي تأثير مضاد للورم ضد الورم المعمول به15.
نظام FTOC الكلاسيكي هو وسيلة لتلخيص اختيار الغدة الصعترية في المختبر. وقد تم استخدامه لدراسة التطور داخل الغدة الدرقية من الخلايا الصعترية23، وهناك عدد قليل من التقارير من FTOC تستخدم لتوليد RTE24. ومع ذلك، فإن نظام لجنة البراءات والمياه والمياه والمياه لديها عدة قيود. للتعامل مع نقص الأكسجين في ثقافة الجهاز الاصطناعي، وقد استخدمت عدة مجموعات إما ثقافة شبه جافة الغشاء القائم23،أو ارتفاع نظم ثقافة غمر الأكسجين25. ومع ذلك، لا توجد طرق الحالية يمكن أن تولد باستمرار مجموعة متجانسة من الخلايا T ما بعد الغدة الدرقية. للتغلب على قيود نظام FTOC الكلاسيكي، قمنا بتصميم نظام ثقافة الغدة الصعترية ثلاثية المفعول الذي يوفر تحسينات تقنية على الطرق التقليدية15. على سبيل المثال، باستخدام طريقة زراعة الثيميك ثلاثية الابعاد، تبادل الأكسجين الأقصى وعدم وجود الإجهاد الميكانيكي للفص السطحي يحافظ على الفصوص الثيميك في بيئة أكثر فسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الثقافة على المدى الطويل بنضج خلايا T للخروج بشكل طبيعي من الفصوص الثيميك. وأخيرا، فإن المراقبة في الوقت الحقيقي والتلاعب الجزئي تمكين تبادل وسائل الإعلام ومجموعة مستمرة من iTE دون إزعاج جسديا الفصوص الغدية. وهكذا، فإن طريقة الثقافة الثيميك ثلاثية المفعول توفر تحسينات تقنية كبيرة، فضلا عن وسيلة لدراسة الخلايا T الساذجة المختارة من قبل التي لم تكن متاحة من قبل.
هناك العديد من النقاط الرئيسية للجيل الناجح من iTE باستخدام هذا النظام ثقافة الغدة الصعترية 3D. جودة FBS وظروف الثقافة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توسيع خلايا OP9/DLL1 دون فقدان قدرتها على دعم تمايز iPSC. ولذلك، نوصي قبل التقييم من الكثير FBS، فضلا عن تمرير باستمرار في الملاءمة 80٪ لمنع تمايز الخلايا والحساسية. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب ثقافة OP9/DLL1 confluent للتمايز في المختبر من iPSC في الخلايا T غير ناضجة، كما يمكن أن تؤثر الاختلافات في الملاءمة على كفاءتها. وأخيراً، فإن العمر الجنيني للفصوص الثيميك أمر بالغ الأهمية لتوليد iTE. نوصي باستخدام E14.5 – 15.5 فصوص الغدة الصعترية.
كما هو الحال مع أي بروتوكول جديد، هذه الطريقة لها قيود وتخضع للتحسين. تقنية الثقافة المعروضة هنا تولد حوالي 1000 iTE لكل فص الثيميك في اليوم الواحد لمدة أسبوعين. قد يكون من الممكن زيادة توليد iTE مع مزيد من التعديلات، بما في ذلك تحسين تركيز الأكسجين، وحجم وسائل الإعلام، ونوع لوحة الثقافة ثلاثية الأقراص. إضافة أو إزالة السيتوكينات، فضلا عن التغيرات في تركيز السيتوكين، قد تسهم أيضا في تحسين العائد iTE.
وبالنظر إلى أن نظام الثقافة الثهيميك 3D المعروضة هنا يمكن أن تولد المهاجرين الغدة الصعترية في نظام الجسم الحي السابق تماما، ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مشاريع البحوث نقل الخلايا المناعية والتبني بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر T تمايز الخلايا، ونضج الخلايا T بعد الغدة الصعترية، وتوليد الخلايا T مستضد محددة من السلف المكونة للدم أو الخلايا الجذعية. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تنطبق مباشرة على العينات البشرية، iTE ونظام الثقافة الثيميك 3D تحمل إمكانات كبيرة لتوضيح الآليات الجزيئية للاختيار الإيجابي والسلبي، ويمكن أن تسهل إنشاء نظام الثقافة التي تمكن توليد الخلايا T ذات الصلة سريريا الورم مستضد محددة السذاجة مثل لACT.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هيروشي كاواموتو وكيوكو ماسودا على تقديم خط الخلية OP9/DLL1. نشكر آلان ب. هوفرينغ وإيرينا زي. هو للمساعدة الرسومية. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من المعهد الوطني للسرطان في الولايات المتحدة (ZIA BC010763) وبرنامج سرطان مونشوت لمركز العلاج القائم على الخلايا في NCI، المعاهد القومية للصحة. كما حظيت هذه الأعمال بدعم من مؤسسة عائلة ميلشتاين.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| 2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
| 2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
| FBS | Gemini | 100-500 | |
| Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
| Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
| Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| MEM powder | Gibco | 61100061 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
| Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| Cell Culture Vessels and others | |||
| 10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
| 12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
| 6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
| Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
| Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
| Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
| Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
| U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
| Experimental Cell lines | |||
| CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
| OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
| Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
| Experimental mouse models | |||
| B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
| C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
| Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
| Antibodies | |||
| Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
| Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
| Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
| Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
| Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
| Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
| Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
| Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
| Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
| Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
| Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
| Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
| Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
| Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
| Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |
References
- Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320-323 (2016).
- Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends of Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
- Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
- Yamagata, T., Mathis, D., Benoist, C. Self-reactivity in thymic double-positive cells commits cells to a CD8 alpha alpha lineage with characteristics of innate immune cells. Nature Immunology. 5 (6), 597-605 (2004).
- Themeli, M., et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nature Biotechnology. 31 (10), 928-933 (2013).
- Serwold, T., Hochedlinger, K., Inlay, M. A., Jaenisch, R., Weissman, I. L. Early TCR expression and aberrant T cell development in mice with endogenous prerearranged T cell receptor genes. Journal of Immunology. 179 (2), 928-938 (2007).
- Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Recherche en cancérologie. 71 (14), 4742-4747 (2011).
- Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Recherche en cancérologie. 76 (23), 6839-6850 (2016).
- Serwold, T., et al. T-cell receptor-driven lymphomagenesis in mice derived from a reprogrammed T cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (44), 18939-18943 (2010).
- Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-treated thymus organ cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Hamazaki, Y., Sekai, M., Minato, N. Medullary thymic epithelial stem cells: role in thymic epithelial cell maintenance and thymic involution. Immunological Reviews. 271 (1), 38-55 (2016).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Rosen, S. D. Ligands for L-selectin: homing, inflammation, and beyond. Annual Review of Immunology. 22, 129-156 (2004).
- Hogquist, K. A., Xing, Y., Hsu, F. C., Shapiro, V. S. T Cell Adolescence: Maturation Events Beyond Positive Selection. Journal of Immunology. 195 (4), 1351-1357 (2015).
- Best, J. A., et al. Transcriptional insights into the CD8(+) T cell response to infection and memory T cell formation. Nature Immunology. 14 (4), 404-412 (2013).
- Schmitz, I., Clayton, L. K., Reinherz, E. L. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. International Immunology. 15 (10), 1237-1248 (2003).
- Nitta, T., Ohigashi, I., Takahama, Y. The development of T lymphocytes in fetal thymus organ culture. Methods in Molecular Biology. 946, 85-102 (2013).
- Ueno, T., et al. Role for CCR7 ligands in the emigration of newly generated T lymphocytes from the neonatal thymus. Immunity. 16 (2), 205-218 (2002).
- Watanabe, Y., Katsura, Y. Development of T cell receptor alpha beta-bearing T cells in the submersion organ culture of murine fetal thymus at high oxygen concentration. European Journal of Immunology. 23 (1), 200-205 (1993).
