뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

모든 동물 실험은 국립 암 연구소 (NCI)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고 NIH 지침에 따라 수행되었습니다. 1. iPSC와 공동 배양용 OP9/DLL1 셀 준비 OP9 배지에서배양 OP9/DLL1 세포(α-최소 필수 배지 [α-MEM] + 20% 비열불열태아소 혈청 [FBS] + 1x 페니실린-스트렙토마이신 + 아스코르브산 [50 ng/mL] 및 모노티오글리세 [100 nM]). OP9/DLL1 세포가 80-95% 합원에 도달하면 마그네슘, 칼슘 및 페놀 레드 프리 인산염 완충식염수린(이하 PBS라고 함)으로 한 번 씻으세요. 0.05% 트립신의 4 mL를 추가하고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 OP9 매질 4 mL을 추가하고, 단일 셀 현탁액을 만들기 위해 파이펫팅하여 세포 층을 해리합니다. 100 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원점 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 흡인하고, OP9 매체의 12 mL에서 재중단한다. 새로운 10cm 세포 배양 페트리 접시에 OP9/DLL1 세포 현탁액의 플레이트 2 mL을 추가하고 OP9 배지의 8 mL을 추가합니다. 2-3일마다 반복합니다.참고: FBS 및 배양 조건의 품질은 iPSC 분화를 지원하는 능력을 잃지 않고 OP9/DLL1 세포의 확장을 유지하는 데 매우 중요합니다. 따라서, 세포 분화 및 노화를 방지하기 위해 80% 수렴에서 FBS 및 통로의 많은 것을 일관되게 미리 평가하는 것이 좋습니다. 또한 OP9/DLL1 셀의 충분한 냉동 재고를 만들고 4-6주마다 새로운 재고를 해동하는 것이 중요합니다. 2. 미성숙 T 세포로 iPSC의 시험관 내 분화 0일째에 OP9/DLL1 동시 요리에서 iPSC 공동 문화를 시작합니다. iPSC를 트립시화(37°C에서 0.05% 트립신에서 5분) 단일 세포 현탁액으로 수확하고, 세포를 수집하고, 300 x g에서 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 수집하였다. OP9 매체의 10 mL 당 1.0 x 105 iPSC에서 상판 및 재중단 세포를 흡인한다. 접시 1.0 x 105 iPSC를 콘립OP9/DLL1 10cm 접시에 놓습니다.참고: OP9/DLL1 10cm 요리는 90-100% 동률에 도달하면 iPSC 분화에 사용됩니다. 합류의 차이는 iPSC 분화의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 3일째에는 오래된 미디어를 흡인하고 10mL의 신선한 OP9 미디어로 교체합니다. 6 일째에, 통로 세포. 각 10cm 의 PS 10 mL로 OP9 접시를 씻으소서. 접시 당 0.05 % 트립신의 3 mL를 추가하고 실온 (RT)에서 3-5 분 동안 배양하십시오. OP9 용지 4mL를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 셀을 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 100 μm 세포 스트레이너 및 원심분리기를 통과시다. 상급을 버리십시오. 분화 매체의 10 mL에서 세포를 다시 일시 중단 (5 ng/mL 마우스 Flt3 리간드 [FLT3L] 및 5 ng/mL 마우스 IL-7와 OP9 매체) 및 플레이트 셀 현탁액을 새로운 10 cm OP9/DLL1 동시 접시에. 9일째에는 오래된 매체를 흡인하고 10 mL의 신선한 분화 매체로 교체합니다. 11일째에 iPSC 콜로니에서 심근세포가 관찰되면, 100 μm 세포 스트레이너를 통해 파이펫팅및 필터에 의해 비부착 세포를 기계적으로 분리한다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오. 상급을 흡인하고 분화 매체의 24 mL에서 다시 중단합니다. 콘립OP9/DLL1 6웰 플레이트(4mL/well)에 iPSC 플레이트를 넣습니다. 15일째에 모든 비부착 세포를 수집하고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 회전하십시오. 2.5.1단계를 반복하여 3-4일마다 비부착 세포를 계속 통과시다. 3. iTE를 생성하는 3D 흉선 기관 문화 수확 마우스 태아 흉엽은 앞서설명한 바와같이 내인성 림프구를 deoxyguanosine(dGUO) 처리에 의해 전개한다. dGUO 치료의 7 일에, 네 개의 새로운 10cm 접시를 가지고 완전한 미디어의 20 mL로 각각 채우기 (로스 웰 파크 기념 연구소 미디어 1640 [RPMI 1640] + 10 % FBS + 1x L 알라닐 – L-글루타민 + 1x 나트륨 피루바테 + 비 필수 아미노산1x 최소 필수 매체 (MEM-NEAA) + 1회 페니실린-스트렙토마이신 + [1:1000] 2-메르카페토 에탄올). 모든 니트로셀룰로오스 멤브레인을 흉엽으로 10cm 접시에 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 넣습니다. 멤브레인에서 개별 로브를 집게로 분리하여 미디어에 잠기도록 합니다. 멤브레인을 버리십시오. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 완전한 매체를 가진 새로운 10cm 접시에 흉엽을 옮기고 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 집게를 사용하여, 접시에 흉엽을 고정 (한 번에 하나씩), 다른 한편으로는 중앙에 100-200 μm 깊은 절개를하고 로브의 절반 직경을 확장하여 T 세포 전구가 로브로 이동을 용이하게합니다. 완전한 분화 매체로 채워진 새로운 10cm 접시에 흉엽을 옮니다 (완전한 매체 + 5 ng/mL 마우스 IL-7 + 5 ng/mL 마우스 FLT3L + 5 ng/mL SCF). 선택적으로, 하부 및 상부 그리드가 있는 3D 배양 플레이트를 사용하는 경우, 매달려 있는 방울의 증발과 건조를 방지하기 위해 두 그리드를 멸균 PBS로 채웁니다. 3.6단계에서 1개의 dGuo 처리된 흉엽을 포함하는 완전 배지의 30 μL을 각 웰 내로 3D 배양 플레이트로 이송한다. OP9/DLL1 공동 배양(16-21일)으로부터 비부착 T 계보 세포(iPSC 유래 미성숙 T 세포)를 수집하고(20 μL 배지 당 2-5 x 103 T 계보 세포에서 재중단) 3D 배양 플레이트의 각 흉엽에 T 계보 세포 현탁액 20 μL을 추가합니다. 37°C에서 5% CO2로 밤새 배양합니다. P200 파이펫을 30 μL로 설정하고 각 우물에서 여러 번 피펫을 피펫한 후 매질에 흡인하여 흉엽을 둘러싼 모든 세포를 제거합니다. 용지를 버리고 30 μL의 완전한 용지를 추가합니다. 이 절차를 5-7 번 반복하여 로브로 이동하지 않는 여분의 미성숙 T 세포를 제거하십시오. 그 후 매일 미디어의 25-30 μL을 변경합니다. 가벼운 현미경 검사법에 의해 4-5일째부터 로브 주변에 iPSC 유래 흉선 이주자(iTE)의 후광 형성을 확인합니다. 로브 중단 없이 미디어를 파이펫팅하여 매일 iTE를 수집합니다. 매일 미디어를 변경하고 약 12 일까지 수집을 계속합니다. 수확된 iTE는 분자 분석(도2, 도3, 도 4및 도5) 또는 생체 내 이식 실험에 사용할 준비가 되어 있다. 4. 항원 제시 세포의 준비 (APC) 자궁 경부 탈구에 의해 C57BL / 6 마우스를 희생하고 위에서 설명한 대로 실험실 담가 매트에 놓습니다. 비장을 제거하고 100 μm 세포 여과기에 놓습니다. 12 mL 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너에 비장을 압축하여 단일 셀 현탁액을 만듭니다. 멸균 된 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 옮니다. 300 x g에서 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 현탁액을 펠렛세포에. 상월체를 흡인하고 적혈구를 배제하기 위해 암모늄 염화물 칼륨 (ACK) 용해 완충액의 2 mL에서 세포 펠릿을 재중단 (RBC). RT에서 5 분 동안 배양하십시오. PBS의 10 mL를 추가하여 ACK 라시스 버퍼를 담금질합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리에 의해 세포를 펠렛. 상월체를 흡인하고 10 mL의 완전한 매체로 세포 펠릿을 재중단하고 10 cm 멸균 페트리 접시로 옮김. 세포 증식을 방지하기 위해 조사 장치 (γ-방사선)를 사용하여 3500 rad로 비장 세포를 조사합니다. 조사된 세포를 즉시 37°C 인큐베이터및 배양하여 하룻밤 동안 되돌려 한다. 조사된 세포를 APC로 사용하거나 세포 뱅커에서 동결하십시오. 5. 항원으로 맥동 APC Neubauer 혈세포계 및 트라이판 블루 염료를 사용하여 조사 된 APC를 실시간으로 계산합니다. 37°C에서 30분 동안 펩티드(hgp100) 또는 뉴클레오프로테인으로 APC를 배양한다. 여분의 펩티드를 제거하기 위해 PBS 10 mL로 APC를 두 번 씻으하십시오. iTE를 계산하고 100 IU IL-2 및 5 ng/mL IL-7로 완전한 미디어에서 1:1 비율로 APC와 혼합합니다. Aliquot 100 μL의 세포의 혼합물(총 농도: 1 x 106 세포/mL)을 37°C에서 48시간 동안 초저 부착 U 하부 96 웰 플레이트 및 배양물의 각 웰내로 하였다. 48시간 후, 세포를 다채널 파이펫을 사용하여 새로운 플레이트로 옮기고 그 후 2-3일마다 통과한다. 3일째에 세포내 항체로 세포를 염색하여 사이토카인 분비 프로파일을 분석하고 유세포분석으로 분석한다(그림 3). 단백질 수송 억제제 (예를 들어, GolgiStop)의 0.67 μL / mL을 추가하고 사이토 카인의 세포 내 축적을 향상시키기 위해 37 °C에서 6 시간 동안 배양하십시오. PBS 10 mL로 씻으시다. 3 mL의 콜드(4°C) PBS에서 세포를 재중단하고 1 mL의 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 천천히 첨가합니다. 10 분 후, 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운하고 상류제를 버리고 10 mL의 PBS로 씻으십시오. 1 mL PBS + 1% FBS + 0.1% 난오계면활성제에서 세포를 재중단하고, 10-15분 동안 4°C에 놓습니다. 항체를 추가하고, 빛으로부터 시료를 보호하고 30 분 동안 4 °C에 놓습니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운하고 상류제를 버리고 10 mL의 PBS로 씻으십시오. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운하고 PBS의 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 세포는 유세포계에서 분석할 준비가 되어 있습니다.