Эффекты вкуса, сигнализации Abolishment белка на кишки воспаление в модели мыши заболеваний воспалительных кишечника
Summary
Здесь мы представляем протокол к исследовать эффект аннулирование дегустация связанных генов на иммунные реакции в декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной модель мыши воспалительных кишечника болезнь (IBD).
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является одним из связанных с иммунной желудочно-кишечные расстройства, включая язвенного колита и болезни Крона, которая влияет на качество жизни миллионов людей во всем мире. IBD симптомы включают боль в животе, понос и ректальное кровотечение, которые могут возникнуть в результате взаимодействия между кишка микробиоты, компонентов пищи, кишечные эпителиальных клеток и иммунных клеток. Это имеет особое значение для оценки влияние каждый ключевой ген, выраженная в кишечного эпителия и иммунных клеток воспаления в толстой кишке. G белка в сочетании вкус рецепторов, включая G белка Субблок α-gustducin и других сигнальных белков, были найдены в кишечнике. Здесь, мы используем α-gustducin в качестве представителя и описать декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной IBD модель для оценки влияние мутаций гена вкусовые на иммунитет слизистой кишечника и воспаления. Этот метод сочетает в себе технологии Нокаут гена с моделью химически индуцированных IBD и таким образом могут применяться для оценки результатов вкусовые гена аннулирование, а также других генов, которые могут exuberate или ослабить DSS-индуцированной иммунный ответ в толстой кишке. Мутантных мышей управляются с DSS за определенный период, в течение которого контролируется и Записанная их веса тела, стул и ректальное кровотечение. На разных timepoints во время администрации, умерщвлены некоторые мышей, затем измеряются размеры и вес их селезенки и двоеточия и кишечника ткани собираются и обрабатываются для гистологического и анализа выражения гена. Данные показывают, что результаты нокаут α-gustducin в чрезмерная потеря веса, понос, кишечное кровотечение, повреждение тканей и воспаления против мышей дикого типа. Так как выраженность воспалительных процессов индуцированных зависит от мыши штаммов, жилищных условий и диеты, оптимизация DSS концентрации и администрации продолжительность эксперимента является особенно важным. Настроив эти факторы, этот метод может применяться для оценки как анти – и про воспалительных последствия.
Introduction
Два основных форм воспалительных заболеваний кишечника (IBD), болезнь Крона (CD) и язвенного колита (UC) характеризуются хроническим проверят или прогрессивный воспалительных кишечника с многофакторной этиологии1,2 . Развитие IBD зависит от генетических, а также некоторых экологических факторов, таких как диетические, использование антибиотиков и главное, патогенных инфекций. Однако этиологии и молекулярные механизмы регулирования лежащих в основе IBD до сих пор неясны. Таким образом многочисленные химически индуцированных IBD Животные модели построены и применяется к разграничить патогенеза и механизмов регулирования и оценки эффективности человека терапии3.
Вкус рецепторы являются G белок рецепторы (GPCR) и классифицируются как два основных типа: тип I (T1Rs), и тип II (T2Rs), что обнаружить сладкий, умами и горькая соединений. Вкус сигнальные каскады инициируются tastant привязки к T1Rs или T2Rs, активация гетеротримерные Г белков, состоящий из α-gustducin и Gβγ димер и ведущих к выпуску Gβγ подразделения. Общие Gβγ в свою очередь стимулирует течению эффекторных фермента фосфолипаза C-β2 (PLC-β2). Активированные PLC-β2 затем гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат в два посыльных внутриклеточных вторичных [инозит-1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол] и3 IP связывается и открыть его источник рецептор IP3 R3, выпуская ионов кальция из эндоплазматического ретикулума. Это в конечном итоге приводит к открытию Переходный рецепторный потенциал ионного канала Trpm5 и освобождение нейромедиатора СПС на вкусовые нервы4,5,6,7. Тем не менее сигнальные пути соленым и кислым вкусы разные и независимого от сладкого, умами и горький вкус8. Кроме того компоненты вкуса GPCR и ниже по течению белки существуют в различных тканях экстра полости рта. Недавние исследования показали, что α-gustducin, главный компонент вкус сигнализации, найден выражаться в слизистой оболочке кишечника. Дальнейшие исследования необходимы для понимания функций этих вкус сигнализации компонентов в тканях экстра полости рта9,10.
Метод, описанный здесь используется для характеристики функции вкусовых сигнальных белков, выраженные в тканях экстра полости рта. Мы объединяем трансгенные мыши линии, разработанных для разграничения сигнальных каскадов в вкус почки с моделью химически индуцированных колит. Во многом благодаря его процедурных простоту и патологических сходство человека язвенный колит, декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированного IBD модель наиболее широко используется среди различных моделей химически индуцированных колит11. В этом исследовании мы использовали мышей α-gustducin недостаточным как представитель мыши линия выявить новые функции α-gustducin иммунитет слизистой кишечника и воспаления 1) анализа морфологических изменений в тканях и 2) опробование различия в выражении Цитокины, относящиеся к воспаления в толстой кишке. Этот метод может использоваться для количественно и качественно определить вклад вкусовые сигнальных белков (и другие белки, выраженные в кишечнике) повреждения тканей и кишечные воспаления, когда генетически модифицированные мыши линии для гены имеется интерес. Преимущества данного метода позволяя пользователям для получения комплексных данных в результате действия химических DSS и дефицит гена интереса. Этот метод можно усовершенствовать увеличить свою чувствительность и выявить тонкие кишечных изменения на клеточном и молекулярном уровнях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод может использоваться для quantitively определить влияние мутаций специфических генов вкусовые на воспаление в модели мыши DSS-индуцированной IBD. В полной мере воспользоваться, оптимальная индукция IBD является ключевым шагом. Разработка, колитов зависит от нескольких факторов, вклю…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается за счет субсидий из национального естественных наук фонд Китая (81671016, 31471008 и 31661143030) и национальных институтов здравоохранения (DC010012, DC015819) и Фондом Siyuan.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
